1、未知病原菌的分离鉴定,病原菌检测程序,药物敏感试验,标本,直接涂片、染色、镜检,分离、鉴定,生化试验(书p17-18),血清学试验(玻片凝集法),动物试验(产毒性、分离),初步诊断,分子生物学技术(核酸杂交、PCR、基因芯片 核酸 ),其他检测技术,观察培养特征、形态特征,病原菌抗原检测,形态结构,临床标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序,临床标本,直接涂片、革兰染色、镜检(形态,排列,染色性),血琼脂平板/巧克力血琼脂平板(菌落性状,溶血性,色素),可疑菌落,涂片,染色,镜检,纯培养,生化反应,致病性测定,药敏试验,思考：如何从脓拭子、咽拭子中分离并鉴定病原性球菌？,查病原,标本,脓血便、肛拭
2、子,选择/鉴别培基,生化反应,血清学鉴定,双糖发酵, 橘橼酸盐利用试验,尿素, 靛基质试验,SS平板,中国兰,EMB,未知肠道杆菌的分离鉴定程序,伊红美蓝平板- EMB,Eosin-methylene blue agar,EMB,克氏双糖铁试验,Double sugar iron slant,枸橼酸盐利用试验,Citrate slant,吲哚试验,Indole broth,玻片凝集,一、材料： 5人/组 1.待检标本： 脓拭子、咽拭子、尿液标本、肛拭子1#、肛拭子2# 2.培养基：血平板 3块/组EMB平板 3块/组克氏双糖铁斜面 3支/组动力-靛基质-尿素半固体 3支/组 3.其他：革兰染液
3、、玻片、10%胆盐、靛基质试剂、NS、兔血浆、3%H2O2、沙门氏菌多价血清、志贺氏菌多价血清 二、方法 (实验程序) 三、结果 四、讨论,设计性实验 临床标本中病原菌的分离与鉴定,实验目的 熟悉临床标本中常见病原菌的分离鉴定程序 学习脓汁、痰、粪便、尿液等临床标本的检查方法实验要求 针对病例，对临床标本中的病原菌进行分离和鉴定 实验前制定方案，实验后写出实验报告,实验分组 5人/组 1套标本/组（脓汁、痰、尿液、粪便）进程安排 实验分3次进行,实验材料,脓汁 标本：脓拭子 培养基：血琼脂平板 其他：3%H2O2、兔血浆、生理盐水、革兰染液、玻片等,脓拭子,分离培养 （血平板）,革兰染色,革兰
4、染色,触酶实验,血浆凝固酶实验,实验方案,第1次课,第2次课,实验操作与观察,触酶实验,+,-,触酶实验： 挑取菌落置玻片上； 滴加12滴3%H2O2，观察结果；,实验操作与结果,血浆凝固酶实验,+,-,凝固酶实验： 取生理盐水于玻片上，挑取待检菌置于生理盐水中，制成菌悬液，观察有无自凝现象。 向菌悬液中加1滴兔血浆并混合，观察结果。,实验材料,痰 标本：咽拭子 培养基：血琼脂平板 其他：生理盐水、10%胆盐、Optochin纸片、革兰染液、玻片等,咽拭子,革兰染色,革兰染色 荚膜染色,胆汁溶菌实验,奥普托辛实验,分离培养 （血平板）,实验方案,第1次,第2次,第3次,观察奥普托辛实验结果,实
5、验操作,奥普托辛实验： 挑取菌落涂于血平板上，将optochin纸片贴于接种处； 37培养1824小时，观察结果。,胆汁溶菌实验（平板法）： 在血平板上标记单个菌落 直接在菌落上加一接种环去氧胆酸纳溶液 将平板37孵育2030分钟，观察结果,实验操作,荚膜染色：石炭酸复红单染1.涂片、自然干燥、火焰固定；2.1滴石炭酸复红，立即冲去，镜下观察。,实验操作,实验材料,尿 标本：尿液 培养基： EMB平板 克氏双糖铁斜面培养基 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基 其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等,尿液,离心沉淀 1500转，10分钟,分离培养 （EMB平板）,革兰染色,革兰染色,克氏双糖铁斜面培
6、养基,动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基,观察结果,观察结果,完成靛基质试验,实验方案,第1次,第2次,第3次,实验材料,粪便 标本：肛拭子（1#、2#） 培养基： EMB平板 克氏双糖铁斜面培养基 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血清、志贺菌多价血清、玻片等,肛门拭子1、2,EMB平板,克氏双糖铁斜面培养基,动力- 靛基质- 尿素半固体琼脂培养基,观察结果,观察结果,完成靛基质试验,玻片凝集试验,实验方案,第1次,第2次,第3次,讨论内容,针对实验步骤的讨论； 对结果的分析； 还需要进一步做哪些实验； 此次实验成功或需要改进的地方； 其他,预习：肥达
7、反应,肥达试验 (Widal test)用已知的伤寒沙门菌O、H抗原 、甲型副伤寒沙门菌、肖氏、希 氏沙门菌H抗原的诊断菌液，与 患者血清作定量凝集试验，检测 患者血清中的相应抗体，辅助诊 断伤寒、副伤寒。,Georges Widal in 1896 (French),Widal test,正常值：诊断伤寒：O凝集效价1:80, H凝集效价1:160;诊断副伤寒：O凝集效价1:80, H凝集效价1:80才有诊断价值. 动态观察：抗体效价随病程延长而上升；双份血清升高4倍或以上； O与H抗体的诊断意义：O，H-肠热症(伤寒或副伤寒)的可能性大O，H-患病的可能性小O不高，H-预防接种 / 非特异
8、性回忆反应O，H不高-感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有 交叉反应的其他沙门菌感染 少数病例在整个病程中，肥达试验始终呈“-”: 早期使用抗生素治疗或患者免疫功能低下,Widal test (5人/组),材料： 病人未知血清：1#，2#，3# 菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag） 方法：每组1块多孔板/24支试管；每人2支吸管；,弃0.5ml于消毒缸1 2 3 4 5 6NS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml未知血清(1:10) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5菌液(摇匀) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5ml(4种,1种/人) 1:40 1:80 1:1
9、60 1:320 1:640 (阴性对照)37，水浴过夜（完成一个完整的检验）,方法,TO TH TAH TBH TCH 意义 1:640 1:320 1:640 1:320 1:640 1:160 1:640 1:160 ,肥达反应结果举例:,发病早期,不久前患过伤寒/菌苗接种/非特异回忆,伤寒,副伤寒甲,肖氏副伤寒,“O”抗原凝集现象：（呈颗粒状薄膜）100凝集：“”：上层清亮，底部完全凝集，呈颗粒状薄膜（有卷边）。 75凝集：“”：上层不太清亮，底部凝集明显。 50凝集：“”：上层混浊，下层凝集。孔底中央中间约 50白色沉淀，周围膜状凝集，约50。 25凝集：“”：液体比较混浊，膜状凝集少。 0凝集：“”：如第6孔，混悬后，混浊均匀，底部无凝集。,“H”抗原凝集现象：（呈絮状凝集）100凝集：“”：液体清亮，底部中央完全凝集，呈蓬松絮状；混悬起来，液体仍然清亮，分散开的絮状凝集块漂浮于液体中。75凝集：“”：上层不太清亮，底部絮状凝集明显。50凝集：“”：混悬后，上层均匀混浊，下层絮状凝集约50。25凝集：“”：混悬后，液体比较混浊，絮状凝集少。0凝集：“”：如第6孔，混悬后，液体均匀混浊，底部无凝集。,实验报告,班级 学号 姓名 日期肥大反应(Widal Test) 一、实验目的要求： 二、实验材料： 三、方法： 四、结果：抗原 抗体效价OHPAHPBH 五、讨论,
