1、病毒 TCID50测定（组织半数感染量）操作步骤(1) 准备细胞 取出一块细胞培养板，每个孔大约传 800010000 个细胞（一个 T25 瓶的细胞消化后加 10ml 培养液正好传一块 96 孔板，要传匀） 。每个孔的细胞铺成单层大约 60丰度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用） 。细胞对照选取 16 个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。(2) 稀释待测病毒液。A 法为参考书上标准的操作方法B 法参照书将液体量减少后的结果病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。A 向每支试管中加
2、入 1.8ml 病毒稀释液。向 1 号试管中加入 0.2ml 病毒，依次 10 倍系列稀释至适宜浓度，最后一支试管。B 在 EP 管中用无血清的孵育液 10 倍倍比稀释病毒原液(10 -1，10 -210-10 等)，根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。根据接种的孔数稀释病毒，常规每个稀释度接种 4 孔，则每个稀释度配500l，即 10-1 为 50l 加入 450l 的孵育液中；如每个稀释度接种 8 个孔，则各配制 1ml，即 10-1 为 100l 加入 900l 孵育液中。若接种 8 个孔，则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的，可以根据接种的量自行调整。
3、【！此步操作注意事项：1）建议每个稀释度接种 8 个孔，若要统计分析则还要增加至 16 个孔。2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。2）此过程中需要使用加样器和 tip 头。使用前用 75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射 20min，确保无菌。使用新高压的 tip 头，外包装一定在超 净台（或安全柜中打开）。 】(3) 接种取细胞培养板，用多道加样器（又称排枪）吸去 96 孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附） 。将稀释好的病毒液加到 96 孔板上，每孔 100l，根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高
4、稀释度到低稀释度（10 -1，10 -2 ）到原液加样。 【切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复 4 次，计算标准差。 】37CO2 培养箱中孵育 1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔） ，加入维持液 200l 继续在 37 CO2 培养箱中培养。(4) 培养将培养板放置于 CO2 培养箱。培养温度 ，培养 天。(5) 测定结果取出培养板，显微镜下观察细胞病变。计算方法1) Spearman-Karber 法LgCCID50 /0.2ml= - （ X0 - d/2 + dR1/N1） X0 = 全部病变最低稀释度对数d = 稀释因数对数N1 = 每个稀释度所种的孔数
5、R1 = 病变孔数 = 积和 LgCCID50 /ml = LgCCID50 /0.2ml +0.72) Reed-Muench 法观察 CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的 TCID50由表看出，能使 50%细胞管出现病变的病毒稀释度在 10-410-5 之间，其中间距离比例按 Reed 和 Muench 公 式 计算：TCID50 高 于 50%病 变 的 病 毒 最 高 稀 释 度 的 对 数 距 离 比 例故能使 50%细胞管发生病变的病毒稀释度为 10-4.5，即 TCID50 为 104.5 倍，当病毒悬液做 104.5 倍稀释时，0.1ml 中含 1 个 TCID50，作其他一些实验时（如中和试验） ，一般常用 100 TCID50/0.1ml。3) 判定标准细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。
