1、一. 方法建立的步骤二开始前应知道1. 样品的性质在开始方法建立之前，我们应该检查自己对样品的了解程度，并明确分离目标。表 1 有关样品组分和性质的重要信息所含化合物的数目化合物的化学结构（官能团）化合物的分子量化合物的 pKa 值化合物的 UV 光谱图化合物在样品中的浓度范围样品的溶解度样品的化学成分能够为选择 HPLC 分离的最佳初始条件提供有价值的线索根据已知的样品信息，HPLC 方法建立有两种不甚相同的模式。一种模式依据样品的“化学性质 ”选择最佳初始条件，色谱工作者需很大程度依赖于过去的经验（如类似结构化合物的分离）和/或用文献资料补充现有信息而另一种模式则直接开始色谱分离，而对样品
2、的性质不大注意这两种 HPLC 的方法建立模式可分别称为理沦型与经验型初始分离一旦开始，可以根据类似的思路（理论的与经验的）选择进一步的实验。2.分离的目的HPLC 分离的目的必须十分明确，下面的问题在建立方法之初就应确定：（1）主要目的是什么？定量或定性，还是定性、定量同时做？；（2）是否有必要解析出样品的所有成分？譬如可能有必要分离出产品中的所有降解物或杂质，以使含量测定结果更加可靠，但却没必要将它们彼此完全分开。（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品主要成分的精密度通常能达到12%，特别是不需样品预处理的情况。（4）特殊化合物可能会以不同的样品形式出现（如：原料药，一种或多种形
3、态，环保样品等）。是否需要一种以上的 HPLC 方法？单一方法分离不同形态样品是否理想？（5）一次将分析多少样品？当必须同时处理大量样品时，运行时间将变得非常重要。有时甚至为了缩短运行时间而以牺牲样品分离度作代价，如缩短柱长或加快流速。当一次分析的样品数目超过 10 个，运行时间一般应控制在 20min 以内。（6）将要使用该方法的实验室中，有哪些 HPLC 设备？色谱柱能否恒温系统能否做梯度洗脱？该方法是否可在不同设计与生产的设备上运行？方法建立实验开始之前，应明确对方法的这些要求。三. 样品的预处理和检测1. 预处理：样品来源形式不同，可能以如下形式出现：（1） 可直接进样的溶液；:（2）
4、 需稀释、pH 缓冲、加人内标或其它定容操作的溶液；（3） 必须首先溶解或提取处理的固体；。（4） 样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害。可直接进样的样品有操作方便、精密度好的优点，然而大多数 HPLC 分析的样品需称重或稀释定容后才能进样。当样品溶剂成分接近于流动相时，一般不会产生基线波动等问题，通常能够得到较好的结果。有些样品在注入 HPLC 前需进行部分分离（预处理），以除去干扰物、浓缩样品或消除“柱杀手” ，因此了解样品和各种被测物的浓度范围非常重要。2. 检测：HPLC 方法建立期间，在第一次进样前，我们必须有把握所选择的检测器能检测到所有的被测样品组分。通常首选可
5、变波长紫外(UV)检测器，因这种检测器使用方便，且可用于大多数样品。UV 光谱数据可从文献中查找，也可通过所测样品成分的化学结构估算，直接测得（如果可拿到化合物纯品）或在 HPLC 分离期间用二极管阵列检测器（PDA）得到。样品对 UV 检测响应不足时，可考虑使用其它类型检测器(荧光，电化学等)，或衍生化样品使检测信号增强。四. 建立分离方法1. 选择 HPLC 分离模式与起始条件首先，我们要确定使用什么方法最合适；如果我们选定 HPLC 分离模式，将样品分为一般样品或特殊样品。一般样品为小分子典型混合物，用近乎标准化的起始条件即可分开。而样品特殊需用特殊的色谱柱和特定的条件才能很好地分离。一
6、般样品可进一步分为中性或离子样品。离子样品包括酸、碱、两性化合物和有机盐类( 电离的强酸或强碱)。如样品为中性，一般不需在流动相中加缓冲液或添加剂，但对于酸或碱性样品，通常需在流动相中加入缓冲剂。碱性或阳离子样品，推荐用“ 弱酸性 ”的反相色谱柱，流动相中加人胺添加剂可能对分离有利。首次实验完成后，再按照结果系统地加以进一步完善。样品的性质HPLC GC CE SEC TLC一般样品 特殊样品中性的 离子的 无机离子异构体 对映体生物样品等 度 肽 类糖 类梯 度 大分子蛋白质离子对 核 酸糖 类正 相 合成聚合物图 1. 利用样品的有关条件，选择初始实验分离条件表 2 特殊样品的处理样品 要
7、求无机离子 检测为主要问题；使用离子色谱异构体 有些异构体能用反相 HPLC 分开，可分为一般样品类中；用(I)正相 HPLC 或(2)环糊精硅胶色谱柱的反相分离能较好地分离异构体对映体 分离这些化合物需要 “手性”条件生物样品 多种因素如分子构象，极性官能团和宽范围的疏水性使这种样品很特殊大分子 “大” 分子需要大孔径的色谱柱填料 (10.m 孔径)表 3 首次 HPLC 分离的较好实验条件分离条件 较好的首要选择色谱柱尺寸( 长度,内径 ID)粒度固定相154.6cn5um a.C8 或 C18流动相溶剂 A 和 B 缓冲液乙睛%B 80100% b.缓冲液(化合物、pH、浓度) 25mM
8、 磷酸钾， 2.0pH3.0 c.添加剂(如胺改性剂、离子对试剂) 开始时不用流速 0.52.0 ml / min温度 3545样品大小体积重量 d.25ul100ug备注：a. 3.5um 微粒为另一选择； b. 用于初始等度分离；初始用梯度实验较好；c. 中性样品不需要缓冲液； d. 小体积色谱柱（如 7.5*0.46cm,3.5um）需要的量更小。表 4 主要 HPLC 方法的特性方法/特点/色谱柱 何时应该使用该方法反相 HPLC流动相：水有机溶剂色谱柱：C18(ODS)、C8、苯基、三甲基硅烷能溶于水一有机混合液的大多数样品尤其是中性或非离子化合物的首选(TMS)、氰基离子对 HPL
9、C流动相：水一有机溶剂，控制 PH 的缓冲液和离子对试剂色谱柱： C18、C8、氰基离子或可电离的化合物，尤其是碱或阳离子样品的良好选择正相 HPLC流动相：有机溶剂混合液色谱柱：氰基、乙醇基、氨基、硅胶当反相或离子对 HPLC 无效时的第二个良好选择石不溶于水一有机混合液的亲脂样品的首选品异构体混合物和制备规模 HPLC 的首选( 最好用硅胶此处推荐的所有色谱柱除了未键合硅胶)均用健合相硅胶微粒装填。当分离目的是为了分离制备纯样品时，优化的最终 HPLC 方法将不同于用于常规定量分析的方法。2. 开始建立方法在首次进样之前，唯一需做的选择是流动相中的有机调节剂比例（%B）。通常不推荐用中等强
10、度的流动相开始方法建立。更好的选择是先用非常强的流动相（如 80%100%B），然后按需要降低%B。另一种有别于起始等度分离的方法是梯度洗脱，梯度分离一般使样品分离得更好。3. 改善分离在 HPLC 定量分析中，分离开是首要要求。基线分离是提供精确结果的有效保障。含有 5 个组分或更少的样品，使谱峰之间达到基线分离（R1.5)一般较为容易。分离度会随色谱柱的使用时间逐步降低，也会由于分离条件的微小波动而在不同时间有所变化，因此在建立简单混合物的分离方法时，最好使 R2。这样的分离度将有利于改善测试精度和方法的普适性；含 10 团种或 10 种以上组分的样品，分离一般会很困难，目标分离度往往必须
11、降低至 R1.01.5。表 5 HPLC 方法建立的目标目标 评论分离度 精密和普适性好的定量分析要求 R1.5分离时间 510min 时日常工作较理想定 量 含量测定：2%(1SD)；要求不高的分析：5 %；痕量分析：15%压 力 （如果为新柱）l50bar 最好，200bar 通常是基本的要求峰 高 大信噪比的窄峰最好溶剂消耗 每次运行少用流动相最好注：大约按重要性递减排列，但因分析要求不同而异。有些 HPLC 测定不必使全部被测组分达到基线分离，这种情况最常见于所测样品中可能存在数种化合物但仅需检测其中的一种时。比如在普查水或土壤样品中的某污染物(如定性分析不同的除芳剂)时，仅需要分离出
12、个别除莠剂，确定其特征保留时间进行峰鉴别即可。尽管大多数 HPLC 设备能在更高的压力下工作，使用新色谱柱的工作压力不应超过 170bar（2500psi , 17MPa），压力上限最好在 2000psi 以下。限制该压力基于两点原因：第一. 随着色谱柱的使用，微粒杂质会逐步堵塞柱头，使柱压成倍升高；第二. 较低的压力（ 170bar）适于泵、进样阀、尤其是自动进样装置的稳定工作，密封垫的寿命更长，色谱柱堵塞的情况减少，系统的耐久性明显提高。因此，最好以小于泵的最大允许压力的 50%作为目标压力。4. 可重现的分离在进行实验时，要能够重现每次实验色谱图。在方法建立过程中改变实验条件（流动相、色
13、谱柱、温度）时，必须经过足够长的时间使色谱柱在新流动相和温度下达到平衡。通常以 1020 倍柱体积的新流动相冲洗色谱柱后，色谱柱可达到平衡。五HPLC 方法的完善最后的实验方案应达到方法建立开始时所设定的所有目标。方法本身在日常工作中应经受住考验，应适用于所有的相关实验室以及人员。1. 定量与方法论证一旦完成了 HPLC 方法建立，应对其进行论证，进行全面论证通常需通过简略核查方法的专属性、线性、准确性、精密度、回收率、灵敏度等而实施。在最终论证方法之前，应准备和检查书面分析方案，使之清晰、严密。实际的论证程序按方法的重要性不同，需时为 1 天一 2 周不等。理想的情况是，通过方法论证能找出可
14、能因仪器和操作者的不同而导致的潜在问题。在日常 HPLC 分析中，柱间重现性可能是主要问题之一。同种方法在不同批号的色谱柱上可能有不同的结果，任何意外的结果都应进行研究，以找出其原因，避免在日后的工作中出现同类错误。表 6 完善方法1. 应预备数据表明所需方法的性能；2. 应有为其它操作者使用的书面分析步骤；3. 以一个以上的系统或操作者，用包括期望组分和期望被测物浓度的样品系统地论证方法的性能；比较不同时间和不同实验室之间的实验数据；4. 应得到色谱柱的期望寿命以及柱间重现性的数据；5. 研究不正常的结果，以纠正潜在的问题；6. 研究所有影响分离的条件（温度、流动相组成、pH 等）；规定这些
15、条件的限度；对可能发生的问题（关键谱峰对分离不足；随运行时间延长，最末谱峰保留值增加等）提出建议措施。备注：主要用于日常工作或质量监控方法上表的要求适用于满足精密准确、稳定可靠并可移植转让的严格 HPLC 标准方法。在其它情况下，可能只要求一次成功的分离或能快速、“粗略”地答复某一特定问题，此时可免掉表 5 和表 6 中的许多建议，图 1 中一些步骤也可能是不必要的，仅明白并知道一个方法建立方案的真实目标就足够了。2. 解决出现的问题随着方法建立的进行，会出现各种问题，其中有些已在表 7 中列出，其它的问题包括：开始时色谱图中有的谱峰可能比所期望的要宽（塔板数低），或谱峰严重拖尾；在方法应用中
16、还会发现用同一（或不同）厂家的“规格相同”色谱柱替代原柱后，分离情况会变得难以接受，常规实验室无法用（规格相同的）另柱重复此方法；色谱柱寿命也可能很短（如进样不足 100 次即不能再用）；（同一色谱柱）重复进样的色谱图不一样，定量精度较差，保留时间从一系列运行的开始直至结束一直漂移；在后面样品的色谱图中可能出现了其它峰干扰被测物测定等。表 7 方法建立和论证期间可能出现的问题问题 评论塔板数低 色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响色谱柱易变性 色谱柱选择不对，二次保留的影响色谱柱寿命短 色谱柱选择不对，样品需预处理保留值变化 色谱柱平衡不够，样品需预处理，键合相流失定量精度差 需更好地校正，找出误差的来源出现新的千扰峰 初始分离不够或初始样品无代表性对于将长期使用的常规方法，最好在正式应用之前，对这些问题进行预测并加以改善。进人日常应用后才发现方法性能不好是不愿看到的情况，方法重现性差会影响质量控制或生产实验室的工作。3. 方法的普适性普适性好的方法指能容忍实验条件的微小变化、一般色谱工作者容易掌握、应用时也不必使用同一 HPLC 系统的方法，可移交他人使用。在论证期间，方法的普适性可通过深人细致地试验对该方法加以确证；也可将其设计成一种程式，研究不同条件对分离的影响。
