1、植物蛋白酶提取纯化工艺生物工程 09-2 班 陈福泉 学号：3090343214一、 实验目的1、了解植物蛋白酶常用的提取纯化方法的基本原理和基本操作；2、掌握双水相和反胶束萃取的原理和操作步骤；3、掌握蛋白质含量和蛋白酶酶活的检测方法二、 实验原理植物蛋白酶常用的提取纯化方法有缓冲盐溶液提取、初步纯化的方法有有机溶剂法、乙醇粉法、丙酮粉法、盐析法、双水相法、反胶束萃取法等以 pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高，最佳工艺为：以 pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液 25提取 2次，料液比 11；应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化，粗酶液再以 60%硫酸铵
2、盐析 24h，透析袋（14000）低温透析 12h，冻干；酶学性质研究表明：生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适 pH值为 6.0，30保温 30min，酶活稳定。三、 实验材料材料与试剂新鲜生姜、酪蛋白（化学纯） 、考马斯亮蓝 G-250、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸、硫酸铵、丙酮等试剂均为分析纯。0.01%（w/v）考马斯亮蓝 G-250溶液：将 100mg考马斯亮蓝 G-250溶于 50mL 90%vol乙醇中，加入 85%正磷酸 100mL，蒸馏水定容至 1000mL。0.5%酪蛋白溶液：称取 0.5g酪蛋白，先用少量 0.55mol/L碳酸钠溶液润湿，再加少量0.0
3、2 mol/L pH7.5的磷酸缓冲液稀释，水浴中煮沸溶解，定容至 100mL。四、 实验步骤方法一：生姜蛋白酶提取液制备: 取定量新鲜生姜,切成小块后加入 10 倍体积的pH 6. 0, 0. 2 mol/ L 磷酸缓冲液( 4 e ) , 于粉碎机中匀桨, 8 层纱布过滤后于4000 rpm 离心 10 min, 吸取上清液, 加入高饱和度的 ( NH4) 2SO4 液使盐析体系中( NH4) 2SO4 终饱和度为 60% , 4000 rpm 离心 15 min。收集上层不溶物 , 用少量 pH 7. 50 的柠檬酸缓冲液溶解, 在 4 e 下对同种缓冲液透析 8 h。透析液定容, 即为
4、生姜蛋白酶提取液。方法二：生姜蛋白酶的提取 取外形完好、无机械损伤和腐烂、富含纤维的生姜，切成小块，与磷酸缓冲液（0.03mol/L，pH7.5，内含 1 mmol/L EDTA和 5mmol/L L-半胱氨酸）按料液比 1：2 打浆，所得浆液低速搅拌 20m i n，搅拌过程中缓慢加入20（m/v）固体硫酸铵，四层纱布过滤后，将姜汁 4 下静置 2h，离心（4 800rpm，5min）去除沉淀，上清液用 1.5倍的无水乙醇进行沉淀，再次离心去除上清液后收集沉淀（即粗酶） 。生姜蛋白酶的反胶束萃取：在生姜蛋白酶提取液加入等体积的 AOT-异辛烷阴离子反胶束或 CTAB-庚烷/ 辛醇阳离子反胶束
5、, 用磁力搅拌器以 200 rpm 的速度进行搅拌510 min, 8000 rpm 离心 10 min, 萃余液( 下层 ) 用考马斯亮兰法测定残留生姜蛋白酶酶活力和蛋白质量。生姜蛋白酶的 pI= 5. 4 5. 5, 在 pH 5. 4 以上, 用 AOT-异辛烷反胶束不能萃取出生姜蛋白酶, 但是却可以萃取出 71. 86% 的杂蛋白。用 CTAB 庚烷/ 辛醇反胶束二次萃取 AOT-异辛烷萃余液, 其蛋白质萃取率为 60125%。双水相萃取 将不同分子量的聚乙二醇和成相盐按质量比配制一系列不同浓度及 p H的双水相体系，每个双水相体系改变一个参数。由于备用溶液黏度很高，为减少误差，各组分
6、含量均以质量分数（w）表示。加入一定量的聚乙二醇和下相盐后用去离子水调系统总质量至 20g。充分溶解后倒入 60m l的分液漏斗中进行分相，待分相完成后加入3m l的生姜蛋白酶粗酶液。将分液漏斗封口，反复倒置 23m i n，每分钟 1015 次，将体系各组分充分混合均匀后，室温下静置分相 2h，使体系上下相分离完全。资料表明，P E G-缓冲盐双水相萃取生姜蛋白酶的最佳萃取条件为：P E G分子量为 4000，P E G浓度为 20，磷酸缓冲液的 p H值为 6.5，浓度为 10，生姜蛋白酶上相酶活力回收 R和纯化倍数 P F可达 279.05和 1.86生姜蛋白酶活力测定绘制标准曲线配制各
7、取 6 支刻度试管, 分别加入 0. 4、0. 8、1.2、1. 6、2. 0、2. 4g 牛血清白蛋白 2 滴 1:1 HCl,及 3 mL 考马斯亮兰 G-250 液, 室温下显色 30 min后用蒸馏水定容至 10 mL, 于 595 nm 下测定 OD595。以蛋白质质量为横坐标, OD595 为纵坐标绘制标准曲线。其线性回归方程为:Y= 01019X- 0. 001。蛋白质浓度测定取定量蛋白溶液, 加入 pH= 6. 0 的磷酸缓冲液 3 mL, 3 mL 考马斯亮兰 G-250 液及 2 滴 1:1 HCl,室温下显色 30 min 后用蒸馏水定容至 10 mL, 于 595 nm
8、 下测定OD595, 根据标准曲线或线性回归方程计算蛋白质含量。生姜蛋白酶活力各取 0. 2 mol/ L、pH= 6. 0 的磷酸缓冲液 3 mL,分别加入 0. 2%牛血清白蛋白溶液 2 mL 及 1 mL 生姜蛋白酶溶液, 于 60 e 下反应 15 min, 反应完成后加入 2 滴 1B1 HCl 以终止反应, 对照则在加入生姜蛋白酶溶液之前加入同量 1B1 HCl 以阻止反应发生。加入 3 mL 考马斯亮兰 G- 250 液显色 30 分钟后定容至 10 mL。分别于分光光度计上测定 OD595,以反应前后 OD595 差表示生姜蛋白酶活力。以每分钟内每 mL 蛋白酶提取液水解 1
9、g 牛血清白蛋白为生姜蛋白酶的活力单位。生姜蛋白酶活力= ( 酶反应液 OD595-空白 OD595) / mL 酶液 min- 1, 即 g 牛血清白蛋白/ mLmin- 1。1安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。2配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度3制备凝胶板：（1）分离胶制备：按表配制 20ml 10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约 8cm 高，用
10、1ml 注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约 34mm 高，以进行水封。约 30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。（2）浓缩胶的制备：按表配制 10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 0.5cm 处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约 30min后凝胶聚合，再放置 2030min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将 pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约 0.5cm 以上，即可准
11、备加样。4样品处理及加样各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为 0.51mg/mL，沸水浴加热 3 分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热 1 分钟，以消除亚稳态聚合。一般加样体积为 1015L（即 210g 蛋白质） 。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。5电泳将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至 10mA。待样品进入分离较时，将电流调至 2030 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开
12、移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。6染色及脱色将染色液倒入培养皿中，染色 1h 左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。计算1.相对迁移率 mR =样品迁移距离（cm）/染料迁移距离（cm）2.以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品相对迁移率，从标准曲线上查出其分子量。五、注意事项1. 不是所有的蛋白质都能用 SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原
13、蛋白等。例如组蛋白 F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的 SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是 21,000，但 SDS-凝胶电泳测定的结果却是 35,000。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。2有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在 SDS 和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与 SDS-凝胶电泳的结果互相参照。
