1、 文件编号：HAMK-OI- -2015 版本号：1.0 生效日期：2015 年 12 月 30 日 发放号：1呕吐毒素标准操作规程1、 目的为了规范亲和柱净化样本中呕吐毒素的操作流程，特制订本操作规程。2、 范围本标准适用于粮食、饲料、食品中呕吐毒素的检测。3、 检出限和定量限岛津 安捷伦项目 样本检出限（ g/kg）样本定量限（g/kg ）样本检出限（ g/kg）样本定量限（ g/kg）DON 12.96 36.72 151 5034、 职责部门名称 部门职责质量管理部1、 负责本制度的实施。2、 负责本制度的监督执行。5、 程序5.1 原理测定的基础是抗原、抗体反应，抗体连接在柱体内，样
2、品经过提取、过滤后，缓慢的通过呕吐毒素免疫亲和柱，在免疫亲和柱内毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他无关物质。用甲醇洗脱呕吐毒素，然后注入到分析仪器中用于检测。5.2 溶液配制5.2.1 PBS 缓冲液：称取 8.0g 氯化钠，1.2g 磷酸氢二钠，0.2g 磷酸二氢钾，0.2g 氯化钾，用 990mL 蒸馏水或去离子水溶解，用浓盐酸调节 pH 至 7.0，再用蒸馏水或去离子水定容至 1L。上述 PBS 缓冲液用于样品的提取、稀释，以及亲和柱的清洗。5.2.2 呕吐毒素标准工作液：先用色谱级甲醇将高标稀释到 5ppm，再用水将其稀释到1ppm，此时标品的溶剂为 20%甲醇，然
3、后再用 20%甲醇将标准品梯度稀释到500ppb、200ppb、100ppb、50ppb。文件编号：HAMK-OI- -2015 版本号：1.0 生效日期：2015 年 12 月 30 日 发放号：25.3 样品前处理5.3.1 玉米、小麦、面粉、配合饲料、浓缩料、精补料等吸水性较小的样本-将样品粉碎，称取 25g 样品，加入 5g 聚乙二醇，加入 125mL 蒸馏水；-高速均质（10,000r/min）1min（或用摇床 200r/min300r/min 剧烈振荡 20min） ；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；-取 2.5mL 上样液过免疫亲
4、和柱净化。稀释倍数：25.3.2 麸皮、豆皮、玉米胚芽粕、米糠等吸水性较强的样本-称取 10g 样品，加入 100mL 蒸馏水；-高速均质（10,000r/min）1min（或用摇床 200r/min300r/min 剧烈振荡 20min） ；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；-取 5mL 上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.3 酒类-取脱气的酒类样品（含二氧化碳的酒类样品，使用前先搅拌或超声脱气）或不含二氧化碳的酒类样品 25g，用 PBS 缓冲液定容至 100mL；-高速均质（10,000r/min）1min（或用摇床 200r/min
5、300r/min 剧烈振荡 20min） ；-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；-取 2mL 上样液过免疫亲和柱净化。稀释倍数：25.3.4 酱油、醋、酱及酱制品-取样品 25g，用 PBS 缓冲液定容至 100mL；-高速均质（10,000r/min）1min（或用摇床 200r/min300r/min 剧烈振荡 20min） ；文件编号：HAMK-OI- -2015 版本号：1.0 生效日期：2015 年 12 月 30 日 发放号：3-用快速定性滤纸过滤，收集滤液；-滤液再用微纤维滤纸过滤，并收集滤液作为上样液；-取 2mL 上样液过免疫亲和柱
6、净化。稀释倍数：25.4 净化-取出免疫亲和柱，将上方塞子取出斜剪断，再插回亲和(3mL 的免疫亲和柱去掉上方塞子，安装上转接头，将转接头另一端与注射器固定后使用)-将柱子与气控操作架上的注射器连接固定，取适量处理后的溶液上样；-去掉亲和柱下方堵头，调节开关，使液体以 12 滴/ 秒的速度流出；-待液体排干后，方法 5.3.1 中的样品用蒸馏水或去离子水洗涤 2 次，每次 10mL，其余样品首先用 0.1%Tween-20 水溶液洗涤 10mL，再用蒸馏水或去离子水洗涤10mL，流速 23 滴/秒；-待液体排干后，上样 1mL 甲醇，流速 1 滴/秒，收集洗脱液并在 5060加热条件下 N2
7、气吹干，然后用 1mL 流动相（20%甲醇）复溶； -复溶液用 0.22m 微孔滤器过滤后转移至样品瓶中用于 HPLC 分析。* 每次上样前都要将上次液体完全排干。5.5 液相测定5.5.1 液相色谱条件C18 柱：250mm（长）4.6mm（直径） ，填料粒径 5m；流动相：20%甲醇流速：1.0 mL/min；柱温：40；进样体积：50L紫外检测器：218nm5.5.2 色谱定量分别取相同体积样液和标准工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积） ，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线，文件编号：HAMK-OI- -2015 版本号：1.0 生效日期
8、：2015 年 12 月 30 日 发放号：4将未知样本中呕吐毒素的峰面积带入标准曲线，得到试样中呕吐毒素的浓度，标准品色谱图参考下图： 件件:DON-50pb.lcd:-0. 1.02.03.04.05.06.07.08.09.010. 1.012.013.014.0min.0.51.01.52.0mV件A 218nm DON附图： DON-500ppb 标准品液相图谱5.6 注意事项-使用前，免疫亲和柱需回至室温（2225） 。-亲和柱 28储存，不得冻存。-不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。-取样量：根据需要可以适当增加或减少取样量，注意提取液量要相应改变。-柱容量：2000ng，当样本
9、中待检毒素的含量除以稀释倍数高于柱容量时，需要适当降低上样液的体积，重新检测。-pH：亲和柱的上样溶液 pH 需在 68 之间，若偏离此范围需要用盐酸或氢氧化钠调节 pH。-由于样本中呕吐毒素的含量普遍较高，如果计算后样本含量大于 4mg/kg 时，表示已经超过亲和柱柱容量，需要适当降低上样液的体积，重新检测。-上机检测时的溶剂与流动相保持一致可以消除溶剂效应的影响。-呕吐毒素可致癌，应戴手套操作。-使用过的容器及标准品溶液最好用次氯酸钠溶液（5%V/V）浸泡过夜。6、 相关文件免疫亲和柱检验标准免疫亲和柱检验操作规程岛津液相色谱仪标准操作规程安捷伦液相色谱仪标准操作规程7、 相关记录N/A文件编号：HAMK-OI- -2015 版本号：1.0 生效日期：2015 年 12 月 30 日 发放号：58、 附件N/A9、 修改历史记录编号 变更类型 修改条款及主要内容 修改人 修改日期01 A N/A 魏丹丹 2016.2.25变更类型：A 新起草 M - 修订
