1、曲霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒中文说明书1. 用途：曲霉菌半乳甘露聚糖检测（GM 试验）是用微孔板酶免夹心法，检测血清标本中的曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）抗原。2. 应用指征：曲霉菌半乳甘露聚糖检测应与其他辅助检查如微生物培养，病理组织活检以及影像学检查等联合应用，辅助诊断侵袭性曲霉病。3. 简要综述：曲霉菌感染通常发生于吸入环境中存在的曲霉菌孢子之后，在过去的十年中这种侵入形式持续增加，并构成最严重的感染途径。曲霉菌感染主要发生在中性粒细胞减少的病人（在抗肿瘤治疗后）和使用免疫抑制剂（器官移植，特别是骨髓移植）或皮质类固醇的病人。曲霉菌很难从血培养中分离出。它的诊断一般基于非特异性的诊断或影像学
2、依据（临床症状，CT，X 线等） 。目前，血清中的可溶性半乳甘露聚糖（GM）抗原检测是辅助诊断侵袭性曲霉病的血清学方法。4. 检测原理：曲霉菌半乳甘露聚糖检测（GM 试验）是一种单级微孔板夹心免疫酶检测可以检测人血清中半乳甘露聚糖。该试剂盒采用针对曲霉半乳甘露聚糖的大鼠 EBA - 2 单克隆抗体，并且在以往的研究中已经成为其特征。此单克隆抗体用来包被微孔板用以与结合抗原，并检测致敏微孔板上结合的抗原（结合试剂：过氧化物酶结合的单克隆抗体）。血清标本在 EDTA 存在下加热处理为了分离免疫复合物并且使可能影响该实验的其他血清蛋白沉淀。处理过的血清标本和酶标抗体加入到单克隆抗体包被的固相载体上，
3、孵育。GM 抗原由单克隆抗体-半乳甘露聚糖（ GM）- 酶标抗体组成。洗板，以清除未结合的物质。然后，加底物，底物与结合物反应呈蓝色。加酸后反应终止，蓝色变为黄色。标本和质控物的吸光度（光密度）用波长在 450-620nm 的分光光度计测量。5. 试剂说明：霉菌半乳甘露聚糖检测试剂盒产品号为 NO.62796（96 人份）试剂盒储存温度为 2-8C，使用前将试剂平衡到室温（18-25C） 。使用完后，除质控物外，将所有试剂立刻放回 2-8C 储存。试验后，阴性对照，临界（Cut-off）值标准和阳性对照必须-20C 保存。未用完的反应孔装回袋中重新封好，干燥剂勿仍。反应孔打开后 5 周内用完。
4、稀释后，清洗液在 2-8C 可保存 14 天。其他试剂打开后都很稳定直到过期。在最多 9 个批次，试剂足够进行 96 人份测试。成分 内容 数量R1 微反应孔，反应板-96 孔（12 孔 8 条）包被有抗 GM 的单克隆抗体1 个板 /12*8 孔R2 浓缩洗涤液 -Tris NACL 缓冲液 1*100ml-1%吐温 20-0.01%硫柳汞R3 阴性对照血清 -冻干的不含 GM 的人血清-HBsAg，anti-HIV-1 ，anti-HIV-2，anti-HCV 阴性3*qs1ml（qs：量充足）R4 Cut-off 质控血清 -冻干的含 GM 的人血清-HBsAg，anti-HIV-1 ，
5、anti-HIV-2，anti-HCV 阴性3*qs1mlR5 阳性对照血清 -冻干的含 GM 的人血清-HBsAg，anti-HIV-1 ，anti-HIV-2，anti-HCV 阴性3*qs1mlR6 酶结合物 -抗 GM 单克隆抗体/过氧化物酶-防腐剂：0.01硫柳汞1*8mlR7 血清处理液 EDTA 酸性溶液 1*10.5mlR8 TMB（四甲基联苯胺）底物缓冲液-柠檬酸和醋酸钠-0.009过氧化氢-4二甲基亚砜1*60mlR9 显色剂：TMB 溶液（浓缩）-含 0.6TMB 的 90二甲基亚砜溶液 1*1mlR10 终止液 1.5NH2SO4 1*12ml封板条 封微孔板的胶条 1
6、*8 张6.使用警告：1）用于体外诊断使用。2）仅为专业使用。3）不建议测试除人以外血清。4） 阴性对照，Cut-off 对照，和阳性对照是由人血清制造，因此 HBsAg，anti-HIV-1，anti-HIV-2， anti-HCV 要符合 CE 认证标志的阴性标准。并且所有试剂按传染源处理。所有试验必须按照血源性病原体的 OSHA 标准，生物安全 2 级或其他适当的生物安全行为。5） 穿保护性衣物，包括实验衣，眼/面部保护，一次性手套（推荐合成的，非乳胶手套），并且严格遵守实验室操作规范处理试剂和病人标本。试验完毕后彻底洗手。6） 不要用嘴移液。7） 在处理标本和试剂盒的区域不要抽烟，饮水
7、，吃东西。8） 避免标本或试剂飞溅。9） 不含酸的物质洒出来，应彻底用有效地消毒剂擦净。 注意：不要把含有漂白剂的液体放在高压灭菌器内。10)含酸的物质洒出来应该用适量碳酸氢钠稀释分解，并将此区域冲洗并擦干；如果有生物危险物质，用化学消毒剂擦洗。11)所有试验用标本和其他物质都应当做传染媒介，实验室化学和生物废弃物必须按照国家和地方规定处理和丢弃。12）注意：下面列出可能存在危险的化学试剂成分（指五部分试剂）：终止液 7.2的H2SO4 是有腐蚀性的，可能灼伤眼睛和皮肤；如果吞食或接触皮肤是有害的；可能导致很严重的眼睛损伤，包括视力永久的减弱甚至失明。远离强碱和还原剂。R34-41 会引起燃烧
8、。伤害眼睛的风险很大。S24/25-26-30-36/39-60.避免接触皮肤和眼睛。一旦接触到眼睛，立即用大量清水冲洗并求助医生。这些物质千万不能加水。穿适当的保护性衣物，带好手套，做好眼/面部保护。这些物质和他们的容器一定要按照危险废物处理。这些物质的废弃物是危险酸性废物,就算国家或地方规章允许，也必须把它们中和到pH6-9 变成无危险废物处理。0.01硫柳汞，对中枢神经系统有损害的有机汞防腐剂，有生物毒性并足够致敏；持续或反复接触可导致某些敏感个体产生过敏反应；有足够的致敏事件致使稀释硫柳汞。避免释放到环境中，累积效应很危险。含汞浓度超过 0.2ppm 必须按像美国联邦RCRA 危险废物
9、处理（D009），但是，所有废物必须按照当地和国家规章处理。（注：硫柳汞含汞 49.55，所以 0.01 硫柳汞含汞0.005（50ppm ）w/v）。13）物质安全数据表是必要的。7.注意事项：1）在未知条件下，冷藏保存的血清标本出现假阳性结果可能因为被真菌和（或）细菌污染。2）不要用过期的试剂盒，或其中的任何试剂。3）除了浓缩洗涤液（R2 ）和终止液（R10 ）外，不同批号试剂盒的试剂不能混用。4）将所有试剂至室温至少 15 分钟后使用。5）配比试剂时，彻底混匀，操作要小心避免微生物污染。6）不要在有易反应气体（酸、碱、醛）或灰尘存在的条件下做实验，这些物质可能会影响酶的活性。7）用干净的
10、一次性聚丙烯塑料容器盛放底物显色剂。如果必须用玻璃器皿，应首先用 1N盐酸清洗，然后用蒸馏水冲洗，最后干燥处理。8）手工加质控物和标本时，必须换枪头防止交叉污染。9）保证充分洗板，按照说明书设定洗涤循环次数。并确保所有孔全部注满然后全部吸净。不要用挤瓶手工洗涤。10）在洗涤循环结束，然后加试剂之前，避免微孔板干燥。11）酶结合物和底物不能用同一容器盛放。12）酶结合物和底物显色剂不要接触金属或金属离子。13）显色剂避光：TMB 或其他底物显色剂在储存或孵育时要避免见强光。显色液要避免接触氧化剂。14）终止液要避免接触氧化剂，金属和金属离子。15）用干净无尘的器具（试管，枪头，容器等）以减小环境
11、中污染曲霉菌孢子的机率。因为 GM 是热稳定性的，材料消毒不能确保消灭抗原。无热源物质是最好的选择，但是用标准材料要有充分准备。16）限制液体（血清，血清稀释液，酶结合物）或开放容器（微孔板，试管，加样枪）暴露在空气中。17）未用完的酶结合物不能倒回原容器。18)底物显色剂必须是无色的。稀释后一旦出现蓝色说明试剂被污染了，弃去重新准备试剂。8.试剂准备和储存：微孔板（R1）打开的微孔条 2-8可稳定 5 周，用后要封好原袋。洗涤工作液（R2）制备洗涤工作液，浓缩洗涤液和去离子水（蒸馏水）比例 1：9。2-8洗涤工作液能保存14 天。为一次实验制备充足洗涤工作液（80ml 一条：8mlR2+72
12、ml 蒸馏水）。浓缩洗涤液打开后于 2-25保存，在无污染情况下，会一直稳定直到过期。阴性对照（R3）实验之前，将 1ml 去离子纯净水（最好是无热源水）加到装有阴性对照质控品的瓶子内，需要 2-3 分钟充分混匀，然后分装在 3 个聚丙烯离心管内，每个 300l，溶解后暂时不用的阴性对照应立即放-20保存，使用之前要解冻。注意：先溶解再冷冻于-20的质控血清，解冻使用时不用再加水溶解。冷冻的质控品可保存 5 周。质控血清和患者标本以相同方式处理（300l 血清+100l 血清稀释液，等等）。Cut-off 质控血清（R4）和阳性对照（R5）同阴性对照血清底物显色剂（R8+R9）制备底物显色剂：
13、浓缩显色剂（TMB 溶液，R9）与 TMB 底物缓冲液（R8）比例为 1:50。每条反应孔需要 2ml 底物显色剂：40lR9+2mlR8。室温（18-25 ）避光可稳定 6 小时。R8 和 R9 开启后储存于 2-8 ，如没有污染，可稳定直到过期。酶结合物（R6），血清稀释液（R7）和终止液（R10）R6，R7，R10 开启后储存于 2-8，如没有污染，可稳定直到过期。9.标本采集按实验室规范采集血液标本。该实验需用血清，血清标本不能被真菌或细菌污染。要用密封试管，不能暴露于空气中。实验前未打开标本在 2-8可保存 5 天。打开后标本需在 48小时内完成检测。如需长时间储存，存储温度应为-7
14、0。血清标本最多可冻融四次。解冻标本检测之前要充分混匀。20mg/L 胆红素，或相当于 2g/L 甘油三酯的脂血，或 165mg/L 血红蛋白的溶血标本不影响检测结果。有关白蛋白增多的干扰尚未进行测试。10.步骤提供的试剂看试剂说明表格需要但未提供的物质1） 去离子水或蒸馏水，用来稀释浓缩洗涤液。2） 去离子纯净水，用来制备质控血清。3） 吸水纸。4） 一次性手套。5） 防护眼镜。6） 次氯酸钠（漂白剂）和碳酸氢钠。7） 可调或固定移液器,可测量和移取 50l,100l,300l 和 1000l 的量。8） 1.5ml 聚丙烯密封离心管，能耐热 120（加热块）或 100（沸水浴）。 a.螺旋
15、口离心管：美国 Bio-Ra 伯乐 224-0100，1.5ml 锥形管或其他同作用商品。 b.普通微量离心管：美国 Bio-Rad 伯乐 223-9480 EZ Micro Test Tubes 或其他同作用商品。9） 微管盖锁（VWR Cat.#6054001 或他同作用商品）。温度或压力改变时，微管盖锁能安全地阻止密封管帽打开；也能使微量管轻易地从加热块或沸水浴中提起来。10）1.5ml 聚丙烯微量管在实验室台式离心机离心力 10000g。11）浮动的微离心架。12）螺旋搅拌机。13）加热块。推荐以下两种规格：a一块式：Grant Cat.#QBD1(VWR Cat.#460-0074)
16、b.两块式：Grant Cat.#QBD2(VWR Cat.#460-0076)14）加热块中的热块：热块必须用 Grant block Cat.#QB-E1(VWR Cat.#460-8517)15）100的沸水浴箱。16）371微孔板培养箱。17）半自动或自动洗板机。18）装有 450nm 和 620nm 滤光器的酶标仪。试验评估每次试验阴性对照，阳性对照和 cut-off 质控物都必须做，以评估检测结果。血清处理所有质控血清：阴性对照（R3），cut-off（R4），阳性对照（R5）必须和其他血清标本同时检测：1） 分别加 300l 被测血清或（质控物）到每个 1.5ml 聚丙烯试管。2
17、） 每个试管加 100l 血清处理液（R7）。3） 用力混合或震荡以彻底混匀试管。固定封好试管以防在加热时管帽打开，如果是普通微量离心管要加锁。不要刺穿管塞。4） 加热块要求：一个加热块 120加热试管 6 分钟。达到规定温度时试管才能放在加热块里。（*）水浴箱要求：如用沸水浴箱：100加热试管三分钟。（*）5） 把试管从加热块或沸水浴箱拿出时要小心放到离心机里。10000g 离心 10 分钟。6） 上清液用来检测 GM 抗原。7） 检测上清液按以下步骤。准备工作完成后，测试之前上清液要放到 2-8储存 48 小时。如果需复检，要处理另外等分的血清。（*）严格按照规定温度和规定时间，用推荐的材
18、料，是实验成功的基础。不要按照仪器显示温度，要用校准温度计，把校准温度计固定在含有矿物油的试管里：加热块中试管里面要达到 120，沸水浴箱里试管里面要达到 100。ELA 操作步骤准确的运用推荐的方法，并要有良好的实验室操作步骤来完成实验。1） 用之前至少要提前 15 分钟将试剂平衡室温（18-25）。2） 需要准备的有：洗涤工作液，底物显色剂，阴性对照，阳性对照和临界值。3） 为在微孔板中的测试血清和对照准备一份图表，为阴性对照血清（R3）预留一孔，临界值对照血清（R4）预留两孔，阳性对照血清（R5）预留一孔。4） 将微孔板架和微孔条（R1）从包装袋中取出，将不用的微孔条连同干燥剂一同放回包
19、装袋中，并且重新密封。5） 用之前要颠倒混匀酶结合物瓶（R6）中的试剂，在每个孔中加 50l 酶结合物（R6），然后，每孔加 50l 处理过的血清标本上清液，如上所述，不能在加酶结合物之前加血清样本。6） 用封板条封板，或别的能防止样本蒸发，确保整个表面被封住和防水的方法。7） 在 37（1）干燥的微孔板孵育箱中孵育 905 分钟。8） 去掉封板条，将孔中物质吸弃到废液瓶（含次氯酸钠）中，洗涤五遍，每次最少370l 的洗涤液，最后洗板后，在吸水纸上倒扣微孔板并轻拍，以吸干残留在上面的液体。9） 每孔迅速加 200l 底物显色剂（R8+R9），并要避光显色。10） 将微孔板避光在室温（18 到
20、25）下孵育 305 分钟。在这次孵育过程中不能用胶膜。11） 在每孔中加入 100l 终止液（R10 ），用相同的加底物显色剂的次序，充分混匀。12） 将每孔的底部擦净。13） 在波长为 450nm（参比波长为 620nm）下测试每孔的吸光度，微孔板必须在加完终止液后 30 分钟内测试完毕。11 质量控制（有效性标准）cut-off：cut-off 质控血清的 OD 值必须大于等于 0.300 小于等于 0.800.阳性对照：阳性对照的比值必须大于 2.00阳性对照比值=(阳性对照（R5）OD 值/ cut-off OD 值平均值)2.00阴性对照：阴性对照的比值必须小于 0.40阴性对照比
21、值=（阴性对照（R3）OD 值/ cut-off OD 值平均值）=0.50 则被认为是半乳甘露聚糖抗原的阳性标本。对于所有阳性患者而言，建议将同一标本的新等分做重复检测，并且重新采集患者样本进行检测。注：如果吸光度值低于 0.00 则可能说明程序或者仪器错误，需要对其进行校正。结果是无效的，并且标本必须重测。建议定期（每周两次）测试“高风险”患者，以提高灵敏度和早期检出率。注：曲霉菌半乳甘露聚糖酶免检测试剂盒用来进行侵袭性曲霉菌病的辅助诊断，用该试剂盒得出的阳性标本应考虑结合其他诊断程序如：微生物学，组织学检查和影像学检查。13 方法局限性1. 阴性结果并不能排除侵袭性曲霉菌的诊断，对于高度
22、怀疑侵袭性曲霉菌病的患者每周应进行两次检测。2.检测 GM 抗原时必须按照曲霉菌半乳甘露聚糖酶免检测试剂盒的步骤进行操作，按照结果的解释来进行分析。3.加样或加试剂错误会导致实验的失败，临床上高度怀疑的患者标本或操作错误的标本应考虑重复检测。4.加样不仔细或加样技巧不熟练会使阳性对照或阳性病人的标本溅到别的孔中导致阴性标本污染。5. 曲霉菌半乳甘露聚糖酶免检测试剂盒不能评估新生儿或幼儿的血清标本。6. 曲霉菌半乳甘露聚糖酶免检测试剂盒对于慢性曲霉菌病和职业综合征的检出率明显降低。7. 积极抗真菌治疗的侵袭性曲霉病的病人对曲霉菌半乳甘露聚糖酶免检测试剂盒的敏感性降低。8. 曲霉菌半乳甘露聚糖酶免
23、检测试剂盒不能检测血浆或其他标本类型例如尿液，肺泡灌洗液，脑脊液等。9. 曲霉菌半乳甘露聚糖酶免检测试剂盒不能用肉眼判定结果。10.真菌的其它属如青霉，交链孢霉，白地霉，拟青霉和组织胞浆菌对检测曲霉菌 GM 所用的大鼠 EBA-2 单克隆抗体也表现出反应性。组织胞浆菌病在美国部分地区流行。11.无临床症状的阳性反应：侵袭性曲霉病的血清 GM 抗原检测比临床症状和影像学改变出现得早，无临床症状的阳性反应通常表现为：病人 GM 试验阳性，不久后被证实确有或可能有侵袭性曲霉病。然而，有许多因素影响检测：a. 无临床症状的阳性反应已经被报道过，特别是幼儿。尽管有一些是真的感染了曲霉菌，但大多数被认为是
24、假阳性。b. 呋喃半乳糖在许多食物中，特别是谷物，谷类制品和奶油甜点中存在。母乳中含高浓度的 GM。因此幼儿要考虑这一因素的影响，并且大多数病人有肠屏障的改变。任何无临床症状的阳性反应都要谨慎解释。c. 有报道说 GM 实验结果阳性是由于服用哌拉西林/ 他唑巴坦。有许多批号的哌拉西林/他唑巴坦被报道 GM 抗原阳性。因此服用哌拉西林/ 他唑巴坦的病人检测出阳性要谨慎并要用其他诊断方法确定。据报道多批号的注射用阿莫西林与克拉维酸检测出 GM 抗原，因此 GM 阳性者要考虑半合成 -内酰胺的影响。d. 无临床症状的阳性反应病人有可能接触了含有 GM 的物品，注射或口服（改变肠屏障） 。病人血清外源性 GM 达到或超过检测阈值，才会出现阳性结果。因此，缺乏其他诊断证据的阳性结果，建议调查病人正在服用的药物，尤其是他们的生产过程和所用的原料来源。
