1、,生物化工 沈俊良,引言,三萜：由30个碳原子组成的萜类化合物，分子中有6个异戊二烯单位，是以六分子异戊二烯为单位的聚合体。 三萜类(triterpenes)在自然界分布广泛，有的游离存在于植物体，称为三萜皂苷元 (Triterpenoid sapogenins)；有的以与糖结合成苷的形式存在，称为三萜皂苷 (Triterpenoid saponins)。游离三萜化合物不溶于水，易于有机溶剂。因三萜皂苷多溶于水，其水溶液振摇后可生成胶体溶液，并有持久性似肥皂溶液的泡沫，故有此名。三萜皂苷多具有羧基，故又称其为酸性皂苷。与甾体皂苷相同，三萜皂苷也具有溶血、毒鱼及毒贝类的作用。,三萜皂苷的分布,三
2、萜类(triterpenes)在自然界分布广泛，菌类、蕨类、单子叶、双子叶植物、动物及海洋生物中均有分布，尤以双子叶植物中分布最多。 主要分布于菊科、石竹科、五加科、豆科、远志科、桔梗科及玄参科。含有三萜类成分的主要中药如人参、甘草、柴胡、黄芪、桔梗、川楝皮、泽泻、灵芝等。 少数三萜类成分也存在于动物体，如从羊毛脂中分离出羊毛脂醇，从鲨鱼肝脏中分离出鲨烯；从海洋生物如海参、软珊瑚中也分离出各种类型的三萜类化合物。,主要内容,1.三萜皂苷的结构类型,2.三萜皂苷的提取分离3.三萜皂苷的结构鉴定,其它,4.三萜皂苷的生物活性,5.三萜皂苷的代表物质,1. 三萜皂苷的结构类型,三萜皂苷是由三萜皂苷元
3、和糖、糖醛酸和其他有机酸组成，已发现达30余种类型，除了个别是无环三萜、二环三萜及三环三萜外，主要是四环三萜和五环三萜两大类。,1.1 四环三萜 达玛烷型( Dammaranes ) 羊毛脂烷型( Lanostanes ) 甘遂烷型( Tirucallanes ) 环阿屯烷型( Cycloartanes ) 葫芦烷型 （Cucurbitanes） 楝烷型（Meliacanes）,1.1 四环三萜 1.1.1 达玛烷型( Dammaranes ),母核：,结构特点：,14位有一个-CH3,17位有一个侧链,C20构型为R或S,8、10位有两个-CH3,代表药材及代表化合物：传统中药人参（Pana
4、x ginseng C. A. Mey.的干燥根）及其红参中的人参皂苷（ginsenosides）。根据苷元的不同可分为A、B、C三种类型，C型属于五环三萜类，A、B型属于达玛烷型。,人参皂苷-Rh2 具有诱导细胞凋亡的作用,人参皂苷-Rb1,1.1 四环三萜 1.1.2 羊毛脂烷型( Lanostanes ),结构特点：,14位有一个-CH3,17位有一个侧链,C20构型为R型,10、13位有两个-CH3,母核：,代表药材及代表化合物：,从补中益气、滋补强壮、扶正固本、延年益寿的中药灵芝(Ganoderma lucidum )中分离得到的ganoderic acid C。,ganoderic
5、 acid C,结构特点：骨架与羊毛脂烷型相似，区别在于19位甲基与9位脱氢形成三元环。,1.1 四环三萜 1.1.3 环阿屯烷型( Cycloartanes ),母核：,从中药黄芪（Astragalus membranaceus)中分离到的黄芪苷I,代表药材及代表化合物：,黄芪苷 I,1.1 四环三萜 1.1.4 葫芦烷型(Cucurbitanes),母核：,特点：骨架与羊毛脂烷型相似，区别在于19位甲基转移至9位。,代表药材及代表化合物：,雪胆属植物(Hemsleya amabilis)中分离得到的 雪胆甲素及雪胆乙素。临床用于急性痢疾、肺结核、慢性气管炎的治疗。,雪胆甲素,1.2 五环三
6、萜（Pentacyclic Triterpenoids）齐墩果烷型（Oleananes）乌苏烷型（Ursanes）羽扇豆烷型（Lupanes）木栓烷型（Friedelanes）,1.2 五环三萜 1.2.1 齐墩果烷型(Oleananes),又称-香树脂烷型，自然界分布很广，有的呈游离状态，有的成酯或苷。,母核：,结构特点: 大多含有3-OH。 A/B，B/C、C/D环皆为反式，D/E环为顺式。 常在11或12位有双键，11位有时氧化成羰基，24、28或30位经常是羧基。 4、20 位各有一对偕-CH3,代表药材及代表化合物：,从油橄榄（Olea europaea）、 葡萄籽(Vitis vi
7、nifera L.)中提取 得到的齐墩果酸。具有保肝降脂作用。,齐墩果酸(Oleanic acid),1.2 五环三萜 1.2.2 乌苏烷型(Ursanes),又称-香树脂烷型，与齐墩果烷型结构的差别在于：齐墩果烷型20位连接2个甲基，乌苏烷型在19和20位分别连接1个甲基。,母核：,齐墩果烷型,车前草(Plantago asiatica L. )、石榴叶(Punica granatum L.)和果实中含有的熊果酸（乌苏酸），可抑制革兰氏阳性和阴性菌，明显降低大鼠的正常体温，并有安定作用。,熊果酸（乌苏酸） Ursolic Acid,代表药材及代表化合物：,1.2 五环三萜 1.2.3 羽扇豆
8、烷型(Lupanes),母核：,结构特点：E环为五元环， C19位-异丙基。末端常有 一个双键。,代表药材及代表化合物：,从白头翁（Pulsatilla chinensis）中分离得到的 23羟基白桦酸,1.2 五环三萜 1.2.4 木栓烷型(Friedelanes),母核：,生源上由齐墩果烯甲基移位演变而来,从雷公藤（Tripterygium wilfordii）（卫茅科植物，对类风湿病有独特疗效）去皮根中分离得到的雷公藤酮（Triptergone）。,代表药材及代表化合物：,2. 三萜皂苷的提取及分离,2.1 三萜皂苷的提取 2.1.1 先醇浸提后除杂质先用乙醇或甲醇为溶剂浸提植物，浓缩后
9、将提取物溶于水，滤去不溶物后于水溶液中加石油醚、苯或乙醚等亲脂性强的溶剂进行萃取，亲脂性杂质转溶于这些亲脂性溶剂中，而皂苷类物质因几乎不溶于亲脂性溶剂仍留在水相。萃取除去脂溶性杂质后的水相，再用正丁醇进一步萃取，皂苷类物质转溶于正丁醇中，而亲水性强的杂质仍留在水相。真空浓缩正丁醇溶液，即得总皂苷粗品。 2.1.2 先脱脂后醇浸提先用石油醚、乙醚等亲脂性强的溶剂处理物料，提取除去亲脂性杂质，然后再用乙醇加热提取，冷置提取液，由于大多数的皂苷类物质难溶于冷乙醇而沉淀析出。,4.2 三萜皂苷的分离和精制 4.2.1 柱色谱 4.2.1.1 硅胶柱层析一般以CHCl3/CH3OH/H2O混合溶剂系统为
10、洗脱剂，对一些分离度差别较大的化合物起到较好的分离效果。但其对分离度差别小的化合物分离差，而且操作时间长，溶剂消耗量大。 4.2.1.2 反相硅胶柱层析常用的有Lichroprep Rp-8和Lobar Rp-8，以梯度甲醇和水洗脱，极性大的成分先被洗脱。,4.2 三萜皂苷的分离和精制 4.2.1.3 干柱快速色谱干柱快速色谱是一种干柱色谱与快速色谱的结合，其填充物采用干法装填，样品由柱顶加入，然后利用空气或氮气的压力使洗脱剂流经填料。 4.2.1.4 真空液相色谱将适宜溶剂中的样品倒入柱顶，抽真空，柱用适宜的溶剂洗脱，先用低极性溶剂，然后逐步增加极性，最常用的流动相是石油醚和乙酸乙酯的混合液
11、。真空液相色谱具有操作简便，处理量大的特点。,4.2.1.5 大孔树脂柱色谱大孔吸附树脂是一类新型的非离子型高分子化合物，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂中，对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子化合物的影响。由于大孔吸附树脂有很好的吸附和分离性能，也适合于工业化的生产。因此，大孔吸附树脂分离法是一种较好的分离方法。在皂苷类成分的分离纯化中，利用弱极性的大孔树脂吸附后。很容易用水将糖等亲水性成分洗脱下来，然后再用不同浓度的乙醇洗下被大孔树脂吸附的电苷类，达到纯化的目的。大孔吸附树脂法在提取皂苷类中有广泛应用，如从罗汉果中提取罗汉果皂苷、从甜叶菊干中提取甜味菊苷、从绞股蓝中提取绞股蓝皂苷
12、等。,4.2.1.6 聚酰胺柱层析聚酰胺分子中含有多数酰胺基，在水溶液中能与羟基通过氢键结合而被吸附，从而与不含羟基的化合物分离，化合物分子中羟基数目越多或其活性越大则吸附越强将粗皂苷类化合物进行聚酰胺柱层析，分别用水、不同浓度的乙醇水溶液进行洗脱，在某一合适浓度即可得到电苷类组分。 4.2.1.7 凝胶柱色谱利用凝胶吸水后能形成凝胶粒子，在其交链键的骨架中有许多大小的网眼。使进入凝胶内部的分子和不能进入凝胶内部的分子进行分离。常用的凝胶有SephadexLH-20、G-10。,4.2.1.8 高压液相色谱高压液相色谱与其它液相色谱相比，其最大的优点是分离效率高，可达2万理论塔板数。对于皂苷，
13、绝大多数的分离过程是以HPLC作为最后的分离步骤。这是由于皂苷具有复杂的结构，而且各种皂苷的结构极其相似，因而用其它的方法难以分离。,一种常用的分离方法,4.2.2 薄层色谱（TLC）常规的制备薄层色谱是一种设备和操作简单、费用低廉却有着很广泛应用范围的分离方法。近年来薄层色谱得到了不断的发展，出现了一些新型薄层色谱法，如双向高效薄层色谱等。这些新方法与常规的制备薄层色谱相比，具有更大的优点，因而被广泛地应用于天然药物的分离纯化中。 4.2.2.1 加压薄层色谱加压薄层色谱是指在水平的薄层色谱板上施加一弹性气垫。该压力的存在使得展开剂被强制流动，因此可以采用更细颗粒的吸附剂和更长的色谱，这样使
14、得分离所需时间短，扩散效应减小，因而分离效果更好。,4.2.2.2 离心制备薄层色谱离心制备薄层色谱是在薄层色谱和柱色谱基础上发展起来的一种新的旋转离心、连续洗脱的圆形薄层色谱技术，分离效果优于常规的制备薄层色谱法和柱色谱法。4.2.2.3 双向高效薄层色谱(2DHPTLC)首先对样品进行部分水解，横向展开，取出片吹干展开剂后，再在浓酸中完全水解，纵向展开、此法简单、快速、准确及微量，在单直链糖苷糖基序列分析中具有独特效果，利用此法已对人参皂苷Rg2及川续断根中皂苷的糖链序列进行分析，并取得满意效果。,4.2.3 逆流色谱逆流色谱是以液相物质为固定相的液液色谱，是一种特殊的多级萃取装置。 4.
15、2.3.1 液滴逆流色谱(DCCC)固定相充满一组彼此相连的细管，流动相以微滴的形式穿过固定相，利用物质在互不混溶的两相液滴中的分配系数不同而达到分离目的。其主要的优点是没有固体吸附剂，不存在着被分离物质的不可逆吸附问题。液滴逆流色谱同其他分离技术相配合，是获得纯皂苷的有效手段。 4.2.3.2 旋转式逆流色谱 (RLCC)具有与DCCC相同的优点，但独到之处在于溶剂不必形成液滴，因此可使用各种溶剂系统。应用RLCC和反相硅胶柱层析相结合的方法，从十蕊商陆（Phytolacca americana.L ）果实的甲醇提取物中分离出了三种新皂苷。,3. 三萜皂苷的结构鉴定,3.1 UV光谱分析 结
16、构中有一个孤立双键：205-250nm 处有微弱吸收; 、不饱和羰基max: 242-250nm； 异环共轭双烯max: 240、250、260nm； 同环共轭双烯max: 285nm。 多数三萜类化合物不产生紫外吸收，但以浓硫酸为试剂测定五环三萜类化合物时，可在310nm处观察到最大吸收，且不受母核上的取代基影响。,3.1 红外光谱分析根据红外光谱A区（1355-1392cm-1）和B区(1245-1330 cm -1）的碳氢吸收来区别齐墩果烷、乌苏烷和四环三萜的基本骨架。 3.2 质谱分析（MS）质谱可用于确定分子量及求算分子式。此外，还可由分子离子丢失的离子碎片的m/z推定或复核分子的部
17、分结构。FD-MS、FAB-MS、ESI-MS在皂苷的解析过程中常被使用。这些质谱均可看到明显的分子离子峰及依次失去糖碎片的离子峰；FAB-MS和ESI-MS还可以给出相应的阴离子质谱。对于新化合物可结合元素分析或HI-MS确定分子式。,3.2 NMR谱 3.1 1D-NMR谱 3.1.1 1H-NMR谱三萜皂苷的1H-NMR谱在确定糖链中糖的数目及糖苷键构型上，能给出重要信息。可获得三萜及其皂苷中甲基质子、连氧的碳上质子、烯氢质子及糖的端基质子信号。糖残基中异头质子信号一般出现在4.36.5ppm，而糖残基中非异头质子一般出现在2.94.3ppm。根据在4.36.5ppm范围内质子信号数目，
18、确定糖苷中糖的数目，从偶合常数判断糖的构型，已成为人们研究三萜皂苷结构的一种常用方法。,3.1.2 NOE差光谱（MODES）NOE主要用来确定两种质子在分子立体空间结构中是否接近，若存在NOE，则表示两者接近，NOE值越大，则两者在空间的距离就越近。利用NOE效应，可以用来确定分子中某些基团的位置、立体构型、糖与糖及糖苷链与苷元的连接位置等。 3.1.3 13C-NMR谱13C-NMR谱是研究三萜皂苷结构比较有效的手段。13C-NMR谱的灵敏度比1HNMR谱低，但13C-NMR谱有较大的化学位移范围，自旋自旋偶合的相对简单性以及与溶剂峰很少重叠等特性，与低分辨率的1H-NMR谱相比，谱线很少
19、重叠，这一特性对三萜皂苷结构中糖链结构的研究有重要意义。,3.1.4 DEPT(Distortionless Enhancement by Polrization Transfer)谱在实验中通过改变照射1H的三个脉冲角度(Q)，使作45、90、135变化并测其13C-NMR谱，可以得到用以区别伯、仲、叔、季碳的13C-NMR谱。 3.2 2D-NMR谱二维核磁共振是二十世纪八十年代初期发展起来的新技术，随着高频核磁共振仪的出现，在八十年代末和九十年代初，二维核磁共振得到了迅速发展，并成为了常规的分析方法。 3.3 3D-NMR谱主要用于生物大分子序列的指认。在三萜皂苷结构研究中，当1D、2D
20、-NMR谱中谱线重叠严重，无法辨析时，使用3D-NMR谱可使相关峰的重叠减少，分辨率提高，这就为lD、2D-NMR谱中谱线重叠严重的信号归属，提供了方便。,4. 三萜皂苷的生物活性,4.1 抗癌活性由于肿瘤的多重耐药性日益严重，寻找高效低毒的天然抗癌药物显得尤为重要，迄今为止，已发现并报道了大量的三萜皂苷具有防癌和抗癌活性。 4.1.1 体外活性许多研究表明三萜皂苷具有抗肿瘤活性。作为中国传统中药的人参，其主要成分人参皂苷具有多种药理作用，人参皂苷Rh1，及其前体Rg1对小鼠宫颈癌(U14)和EAC有明显的抑制作用，具有很强的抗肿瘤作用；此外人参皂苷通过阻止细胞增殖周期的G0/G，期或促使细胞
21、死亡两种方式抑制肿瘤细胞u2os的增殖。,4.1.2 体内活性移殖了黑素瘤和结肠癌的同系小鼠经口服及静脉注射多重方式给予人参皂苷Rh2、Rg3后，可明显抑制癌向肺部的转移。其机理是抑制肿瘤细胞的侵润、粘附及肿瘤细胞诱导的血管生成作用；Rg1灌胃和Rh1腹腔注射对U14均具有明显的抑制作用，可能与其促进细胞因子TNF2A的分泌及其基因表达有关；高勇等的研究结果表明Rg3抑制血管生成作用可能是由于Rg3抑制了肿瘤组织内活细胞生长因子(bEGF)的表达。,4.2 降血糖、血脂作用日本学者Takashi等从云南七叶树(Aesculus assamica)中分离得到两个新三萜皂苷长柄七叶树素(assam
22、icin) I和，首次报道了它们具有胰岛素样活性。西洋参叶总皂苷不仅能降低血糖，还能够降低总胆固醇、甘油酯、低密度脂蛋白，升高高密度脂蛋白，对冠心病和血脂异常有治疗作用，而西洋参叶总皂苷和人参总皂苷都对胰脂肪酶活性有抑制作用。 4.3 保肝作用七叶皂苷钠能显著降低CCl4肝损伤所致的小鼠血清谷丙转氨酶升高，对小鼠实验性肝损伤具有明显的保护作用。三七皂苷和绞股蓝皂苷对酒精引起的肝损伤具有干预、保护作用，能减轻肝脏组织脂肪变性程度。,4.4 抗病毒作用在抗艾滋病HIV的研究中，豆科植物甘草中的甘草甜素(glycyrrhizin)具有体外抗HIV-1的活性，其硫酸盐衍生物能够很好地抑制HIV-1逆转
23、录酶活性。从桔梗(platycodon grandiflorltrn)的根中分离到的三个新三萜皂苷具有抗病毒的活性，能有效抑制HSV-1、呼吸道合胞病毒(RSV)和流感病毒(FluA) 。一定浓度的人参皂苷Rg3、Rb3对HSV-1有明显的抑制作用，阻止病毒吸附于易感细胞，或进入细胞内部，达到抑制或杀伤病毒之效果。,4.5 对心脑血管系统的作用 4.5.1 抗心肌缺血作用人参皂苷Re，Rb1，Rg1，三七皂苷，西洋参总皂甘在局部及体外均能防止动物心肌细胞局部缺血和再灌注引起的心肌损伤，其主要机制是降低血清磷酸肌酸激酶(CPK)的释放，减少心肌Ca2+的累积，防止超氧化歧化酶(SOD)的活性降低
24、，缩小心肌梗死面积，降低乳酸脱氢酶(LDH)活性，降低血清游离脂肪酸(FFA)及过氧化脂质(LPO)的含量，纠正心肌缺血时FFA代谢紊乱和防止脂质过氧化。,4.5.2 对脑损伤的保护作用-七叶皂苷钠对大鼠局灶性脑缺血-再灌注损伤具有明显保护作用，能显著改善脑缺血-再灌注后脑梗死面积，减轻脑水肿，改善神经功能症状，其保护作用可能与抑制局部炎性渗出有关。4.6 抗炎、抗过敏作用三七是五加科人参属植物，传统用于止血化瘀、消肿镇痛。近年来研究表明，三七总皂苷对多种实验性炎症模型具有良好的抗炎活性。,五、代表物质 人参皂苷(ginsenosides),人参中的人参皂苷(ginsenosides):,由20(S)-原人参二醇衍生的皂苷:,由达玛烷衍生的人参皂苷，在生物活性上有显著的差异。例如由20(S)-原人参三醇衍生的皂苷有溶血性质，而由20(S)-原人参二醇衍生的皂苷则具对抗溶血的作用，因此人参总皂苷不能表现出溶血的现象。 人参皂苷Rg1有轻度中枢神经兴奋作用及抗疲劳作用。人参皂苷Rh则有中枢神经抑制作用和安定作用。 人参皂苷Rb1还有增强核糖核酸聚合酶的活性，而人参皂苷Rc则有抑制核糖核酸聚合酶的活性。,Thank you！,
