1、权利要求书 1.一种浓缩纯化肝素的生产工艺，其特点在于，采用扩张柱床离子交换树脂法可将猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜、肝、肺脏等脏器的组织匀浆的提取液不经过预处理直接采用色谱技术分离、浓缩、纯化肝素的生产技术，还可用于粗品肝素的精制，改变了使用传统的离子交换固定柱床吸附技术原料液中不能含有不溶性颗粒的限制。其原理在于吸附介质颗粒在向上流动的液体的作用下膨胀起来，吸附介质颗粒在床体中均匀的悬浮，并按照不同的颗粒尺寸和密度形成梯度而有续的排列，形成一个均衡、稳定的吸附环境，液体中的目标肝素被吸附于介质上，而细胞、细胞碎片、杂蛋白、核酸及杂多糖和其他的组织碎片将通过柱子而流出去，洗脱目标肝素时从相反
2、方向将吸附介质压紧，再用洗脱缓冲液将目标肝素洗下来。扩张柱床色谱技术兼有流化床和填充床的优点，不需预先除去料液中的颗粒而可以直接从料液中吸附目标产物。从而起到有效的吸附分离作用。扩张柱床离子交换色谱技术不但可用于从哺乳动物脏器匀浆液直接提取肝素，还可用于粗品肝素的精制。采用扩张柱床离子交换色谱技术从哺乳动物脏器匀浆液直接提取肝素和用粗品肝素精制肝素，大大降低了肝素纯化工艺的复杂性，提高了产率，降低了生产成本。改变以往的国内树脂法精制肝素的生产中，基本上都是采用分批吸附的方法。分批吸附法理论塔板数低，柱效损失大，纯化效率低，对目的分子吸附不够充分，因此损失大。采用扩张柱床离子交换色谱技术提取肝素
3、，可将肝素与杂质蛋白、核酸及其余硫酸多糖分离，浓缩，纯化一次完成。减少工序，缩短时间，降低成本，提高效率和质量。采用扩张柱床离子交换色谱技术直接从匀浆液中提取肝素，肝素单位效价达到 120U/mg 以上，用粗品精制肝素，效价达到160U/mg 以上，产品中紫外区杂质 (260nm，280nm)均满足药典要求； 技术内容： (1)哺乳动物小肠粘膜的匀浆液经碱盐水解、胰蛋白酶酶解( 猪牛羊等哺乳动物的肝脏肺脏的组织匀浆液加入 0.1-0.5木瓜蛋白酶 )、高温变性和过滤处理，经过在一定离子浓度和 PH条件下进行扩张柱床吸附层析法吸附、浓缩、纯化肝素，乙醇沉淀，丙酮脱水，低温干燥。(2)粗品肝素经碱
4、盐水和胰蛋白酶处理、高温变性和过滤处理，后经过在一定离子浓度和PH 条件下进行扩张柱床吸附层析法吸附、浓缩、纯化肝素，乙醇沉淀，丙酮脱水，低温干燥。工艺流程 粗品制备： a)猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜或肝、肺等脏器的组织匀浆液 50g 左右加水至 250L，加入 NaCI 至 1-8，搅拌、静置、过滤。肠粘膜滤液加入 0.1-0.5胰蛋白酶(肝脏肺脏的组织匀浆液加入 0.1-0.5木瓜蛋白酶 )。 b)在 pH7.5-10.5，35-45下酶解数小时，NaOH 调 pH 至 8.0-10.0，升温至 50-55，保温2-4h，不断搅拌，然后快速升温到 92-95，保持 10-15min，趁
5、热用 80 目滤网过滤，滤液(I)备用。 c)扩张床柱 Streamline50(5cm 内径)、( 购自 Amersham Pharmacia Biotech(瑞典) 装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂。控制温度 40-60，用蠕动泵将 pH 为 7.5-10.5，适量 MTris-HCl 缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。 保持 pH 值不变，将适量滤液 (I)加 MTris-HCl 缓冲液配制成 NaCI 为 2-6，pH 为 7.5-10.5的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中先平衡树脂，然后反复进行离子交换，流速约- -为每小时 2 倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在
6、树脂上为止。 d)然后配制适量的的 2-6氯化钠溶液，MTris-HCl 缓冲液调节 pH3-5，以 23 个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以 5-6 倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度 15-25，流速约为每小时 2.5 柱床体积。 e)关掉蠕动泵，使 D254 树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用约 4 倍柱床体积的 3-8的氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约 2 倍柱床体积的 2-7氯化钠溶液( 用量先多后少 )同法洗脱 2 次。合并全部洗脱液，调节 pH 为 6。 f)按洗脱液体积加入 1.0 倍量的预冷乙醇，沉
7、淀过夜。 g)次日吸除乙醇。沉淀物用 2氯化钠溶液溶解，调 pH 至 6.0。按溶液体积加 0.7 倍乙醇，沉淀过夜。 h)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得肝素，效价为 120U/mg 以上。 精品制备： a)将效价为 60-100U/mg 左右的肝素粗品以 110 的比例溶于 3的氯化钠溶液中，然后再用 2的氢氧化钠溶液调 pH 至 8-11，于室温静置数小时，真空抽滤，去沉淀物，滤液待用。 b)在上述清液中加入 0.01-0.1胰蛋白酶，在 pH7-10，35-45酶解数小时，升温 98-100，10-15min，趁热真空抽滤，滤液备用。 c)
8、扩张床柱 Streamline50(5cm 内径)、( 购自 Amersham Pharmacia Biotech(瑞典) 装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂，用蠕动泵将 pH7-10，适量 MTris-HCl 缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。 d)控制温度 40-60，将适量滤液加 MTris-HCl 缓冲液配制 pH 为 7.5-10.5 的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持 pH 值与温度恒定，流速约为每小时 2 倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止。 e)然后配制适量的预冷的 2-6氯化钠溶液，MTris-HCl 缓冲液调节 p
9、H1-3，以 23 个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以 5-6 倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度2-5，流速约为每小时 2.5 柱床体积。 f)关掉蠕动泵，使树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用用约 4 倍柱床体积的 2-6氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约 2 倍柱床体积的 2-6氯化钠溶液( 用量先多后少 )同法洗脱 2 次。合并全部洗脱液，调节 pH 为 6。 g)按洗脱液体积加入 1.0 倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。 h)次日吸除乙醇。沉淀物用 2氯化钠溶液溶解，调 pH 至 6.0。按溶液体积加 0.7 倍乙醇
10、，沉淀过夜， i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得精品肝素，效价为 150U/mg 以上； 如权利要求 1 所述：扩张柱床离子交换色谱技术的原料为猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜、肝、肺脏等脏器和粗品肝素； - -2.如权利要求 1 所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于扩张柱床离子交换色谱技术用于粗品的加工和精品的制备过程。 3.如权利要求 1 所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于扩张柱床离子交换色谱技术使用强碱性阴离子交换树脂作为吸附介质。 4.如权利要求 1 所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于扩张柱床离子交换色谱技术处理的肝素，可以
11、是钠盐、钾盐、钙盐、锂盐等任何肝素的盐类。 5.如权利要求 1 所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于此技术肝素的处理采用扩张柱床色谱技术。 6.如权利要求 1 所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于此技术肝素的处理采用扩张柱床和离子交换树脂技术。 7.如权利要求 1 所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于此技术在肝素的进一步处理过程中使用胰蛋白酶进一步酶解杂蛋白。 8.如权利要求 1 所述的浓缩纯化肝素的生产工艺，其特征在于此技术采用不同浓度的 NaCl和 Mtris-HCI 缓冲液配合使用达到上样、除杂、洗脱在一个工序中完成。 - -一种浓缩纯化肝素的生产工艺 技术领域 本发明涉及一
12、种浓缩纯化肝素的生产工艺，尤其是一种采用扩张柱床离子交换吸附层析技术浓缩纯化肝素的生产工艺。 背景技术 肝素(heparin)是 1916 年 Mclean 研究凝血机制时从肝脏组织中发现的一种酸性粘多糖。1939 年，Brinkhous 等证明了肝素具有抗凝血活性，从此，肝素作为天然抗凝血物质而受到世界各国的重视。肝素广泛分布在哺乳动物的组织中，如肝、肺、肠粘膜、心、脾、肾、胸腺、胎盘、肌肉和血液等。肝素是一种糖胺聚糖，是由糖醛酸和葡萄糖胺组成的具有不同链长的多糖链的混合物，分子量在 3000-30000D 之间，平均分子量约 12000D 左右。 由于肝素结构复杂，目前肝素主要从天然产物中
13、提取获得，尚无法进行人工合成。 自从 1933 年 Charles 和 Scott 建立了碱盐水提取和胰酶消化的肝素工业生产的原则以来，肝素生产工艺已有了很大的改进。在提取的方法上人们精益求精，并有所创新，如苦味酸法和醋酸钾酸性沉淀法等。 五十至六十年代，各国的肝素生产专利很多，以美、英、匈、捷、日、西德等国较为突出。上世纪七十年代以来，肝素工艺最有意义的新进展是应用胺类化合物和离子交换技术纯化组织提取物。肝素在溶液中以聚阴离子(有独特的临界盐浓度和高电荷密度) 的形式存在，因此可以利用这一特点或者使肝素同各种阳离子(包括胺)结合而从水溶液中沉淀出来，或者使肝素与阴离子交换剂发生交换从而达到分
14、离，而后者更有成本较低、产量较高和操作简便的优点。而国外现致力于原料处理方法的改进和高效价肝素的制备。 近几年，我国广泛而深入地研究形成了几种具有本国特点的比较先进的生产工艺。在我国，肝素的制备过程分两个阶段，即粗品的生产和精制。粗品的生产主要是采用离子交换树脂法，有的结合超滤技术进行除杂质和浓缩。将肝素充分提取出来并防止其结构被破坏是提高肝素收率的关键之一，因此离子交换树脂的性能和工艺是决定收率的关键。肝素的精制过程是去杂质和脱色。精制方法分为氧化法和非氧化法。氧化法主要分为高锰酸钾氧化法和过氧化氢氧化法。目前国内大都采用氧化法对肝素进行脱色，这种精制方法或多或少地对肝素的结构产生破坏作用，
15、其中影响最大的是氧化处理过程。目前国外有的明确提出需要非氧化脱色的产品。 目前，非氧化法制备肝素比较常用的方法是离子交换树脂法。离子交换树脂的性能和工艺是决定收率的关键，要选择好树脂的处理方法和处理时间，使其最大限度地进行肝素的交换吸附。国内离子交换树脂法普遍采用分批吸附的方法，上柱、除杂、洗脱分开进行。这种方法柱效低，对树脂损害大，操作步骤多，费用高，活性成分提取率低。 发明内容 因此，致力于原料处理方法的改进和高效价肝素的制备是几十年来各国肝素研究者孜孜不倦研究的一个方向，随着生物技术的发展，不断有新技术被发现并应用于肝素制- -备工艺。 扩张柱床吸附层析正是适应大规模下游纯化的需求而开发
16、的新的层析技术。其原理在于吸附介质颗粒在向上流动的液体的作用下膨胀起来，吸附介质颗粒在床体中均匀的悬浮，并按照不同的颗粒尺寸和密度形成梯度而有续的排列，形成一个均衡、稳定的吸附环境，液体中的目标肝素被吸附于介质上，而细胞、细胞碎片、杂蛋白、核酸及杂多糖和其他的组织碎片将通过柱子而流出去，洗脱目标肝素时从相反方向将吸附介质压紧，再用洗脱缓冲液将目标肝素洗下来。扩张柱床色谱技术兼有流化床和填充床的优点，不需预先除去料液中的颗粒而可以直接从料液中吸附目标产物。从而起到有效的吸附分离作用。 扩张柱床离子交换色谱技术是将扩张柱床技术用于离子交换色谱的新技术。用扩张柱床离子交换色谱技术不但可用于从哺乳动物
17、的肠粘膜、肝、肺等脏器匀浆液直接提取肝素，还可用于粗品肝素的精制。采用扩张柱床离子交换色谱技术从哺乳动物脏器匀浆液直接提取肝素和用粗品肝素精制肝素，大大降低了肝素纯化工艺的复杂性，提高了产率，降低了生产成本。改变以往的国内树脂法精制肝素的生产中，基本上都是采用分批吸附的方法。分批吸附法理论塔板数低，柱效损失大，纯化效率低，对目的分子吸附不够充分，因此损失大。采用扩张柱床离子交换色谱技术提取肝素，可将肝素与杂质蛋白、核酸及其余硫酸多糖分离，浓缩，纯化一次完成。减少工序，缩短时间，降低成本，提高效率和质量。采用扩张柱床离子交换色谱技术直接从匀浆液中提取肝素，肝素单位效价达到 120U/mg 以上，
18、用粗品精制肝素，效价达到 160U/mg 以上，产品中紫外区杂质(260nm，280nm)均满足药典要求。 本发明人经过反复研究，并通过多次实验，成功将扩张柱床离子交换技术用于肝素的分离纯化工艺，至今为止，还没有发现任何与本发明类似的肝素的提取工艺的报道。 现将这些内容扼要介绍如下： 本发明专利采用扩张柱床离子交换树脂法对粗品肝素进行浓缩纯化及精制。改变以往传统的采用氧化法精制对肝素结构的破坏而造成成品生物活性低，产品质量差，和采用分批离子交换树脂法对目的分子吸附不够充分，柱效损失大，操作步骤繁琐，纯化效率低的缺点。本发明在粗品肝素的溶液中，将肝素与杂质蛋白、核酸及其余硫酸多糖分离，浓缩，纯化
19、一次完成。 本发明减少工序，缩短时间，降低成本，提高效率和质量。在很大程度上降低了生产中有机溶剂的用量，而且提取率比较稳定，粗品肝素溶液采用扩张柱床离子交换树脂法进行浓缩纯化及精制，不仅消除了氧化法和分批离子交换树脂法大量生产时产生的污染液，而且降低成本，大幅缩短生产周期，生产技术成熟，适用于大生产，投资效率高，成本低，效益显著。 本发明既可用于猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜或肝、肺等脏器的组织提取液中提取粗品肝素，又可用于粗品肝素的精制。 取一定数量的猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜或肝、肺等脏器的组织提取液或粗品肝素先配成一定浓度的盐碱水溶液，胰蛋白酶酶解，高温变性，过滤等处理过程后，采用扩
20、张柱床离子交换树脂工艺对提取液分离、浓缩、纯化，乙醇沉淀，丙酮脱水，低温干燥。本技术产品为粗品及精品原料肝素，经过检测各项指标达到产品标准。 粗品制备： - -猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜或肝、肺等脏器的组织匀浆液 50g 左右加水至 250L，加入 NaCI 至 1-8，搅拌、静置、过滤。肠粘膜滤液加入 0.1-0.5胰蛋白酶(肝脏肺脏的组织匀浆液加入 0.1-0.5木瓜蛋白酶 )，在 pH7.5-10.5，35-45下酶解数小时，NaOH 调pH 至 8.0-10.0，升温至 50-55，保温 2-4h，不断搅拌，然后快速升温到 92-95，保持10-15min，趁热用 80 目滤网过滤
21、，滤液( )备用。扩张床柱 Streamline50(5cm 内径)、(购自 AmershamPharmacia Biotech(瑞典)装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂。控制温度40-60，用蠕动泵将 pH 为 7.5-10.5，适量 MTris-HCl 缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。保持 pH 值不变，将适量滤液 ()加 MTris-HCl 缓冲液配制成 NaCI 为 2-6，pH 为 7.5-10.5 的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中先平衡树脂，然后反复进行离子交换，流速约为每小时 2 倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止。然后配制适量的的 2-6氯化钠溶
22、液， MTris-HCl 缓冲液调节 pH3-5，以 23 个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以 5-6 倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度 15-25，流速约为每小时 2.5 柱床体积。关掉蠕动泵，使 D254 树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用约 4 倍柱床体积的 3-8的氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约 2 倍柱床体积的 2-7氯化钠溶液(用量先多后少)同法洗脱 2 次。合并全部洗脱液，调节 pH 为 6。按洗脱液体积加入 1.0 倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。次日吸除乙醇。沉淀物用 2氯化钠溶液溶解，调 pH 至
23、6.0。按溶液体积加 0.7 倍乙醇，沉淀过夜，次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得肝素，效价为 120U/mg 以上。 精品制备： 将效价为 60-100U/mg 左右的肝素粗品以 110 的比例溶于 3的氯化钠溶液中，然后再用2的氢氧化钠溶液调 pH 至 8-11，于室温静置数小时，真空抽滤，去沉淀物，滤液待用。在上述清液中加入 0.01-0.1胰蛋白酶，在 pH7-10，35-45酶解数小时，升温 98-100，10-15min，趁热真空抽滤，滤液备用。扩张床柱 Streamline50(5cm 内径)、( 购自 Amersham Pharmac
24、iaBiotech(瑞典)装入已处理好的强碱性阴离子交换树脂，用蠕动泵将 pH7-10，适量 MTris-HCl 缓冲液自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。控制温度 40-60，将适量滤液加 MTris-HCl 缓冲液配制 pH 为 7.5-10.5 的溶液，用蠕动泵通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持 pH 值与温度恒定，流速约为每小时 2 倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止。 ，然后配制适量的预冷的 2-6氯化钠溶液，MTris-HCl 缓冲液调节 pH1-3，以 23 个沉积床体积的缓冲液平衡 /扩张柱床后，以 5-6 倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程
25、控制温度 2-5，流速约为每小时 2.5 柱床体积。关掉蠕动泵，使树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用用约 4 倍柱床体积的 2-6氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约 2 倍柱床体积的 2-6氯化钠溶液 (用量先多后少)同法洗脱 2 次。合并全部洗脱液，调节 pH 为 6。按洗脱液体积加入 1.0 倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。次日吸除乙醇。沉淀物用 2氯化钠溶液溶解，调 pH 至 6.0。按溶液体积加 0.7 倍乙醇，沉淀过夜，次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得精品肝素，效价为 150U/mg
26、 以上。 扩张柱床离子交换树脂和普通盐解-离子交换树脂特点比较： - -工艺特点： 优缺点比较盐解-离子交换法扩张柱床离子交换树脂法柱前处理须经酸、碱处理和过滤，活性成分损失大，尤其酸解杂蛋白对肝素分子上的 N 一硫酸基破坏，使肝素失活，效价损失严重。酶解处理直接上柱，除杂效果好，步骤少，肝素活性几乎不被破坏。树脂交换处理柱下分批处理，上柱，除杂，洗脱使用大量碱盐水，环境污染大，成本高，效价回收率低，树脂破上柱，除杂，洗脱均在柱上处理，柱效高，碱盐水用量少，树脂使用寿命长。坏大。树脂再生柱下处理，溶剂耗用大，树脂易破碎。处理时间长。柱上再生，节约 2/3 溶剂，树脂寿命长。处理时间短。处理步骤
27、多，约 11 步少，约 7 步质控指标： 粗品肝素产品效价(IU/mg)效价回收率()OD260nmOD280nm盐解-离子交换法15092.30.170.09扩张柱床离子交换树脂法18797.80.110.05从以上比较可以看出，扩张柱床法要比盐解-离子交换法无论工艺还是质控指标都有利于肝素的生产，采用扩张柱床离子交换树脂法生产的肝素更有市场竞争力。 - -上述是扩张柱床离子交换树脂生产工艺流程。 实施例 1 a)猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜的组织匀浆液 50g 左右加水至 250L，加入 NaCI 至3，搅拌、静置、过滤。 b)滤液加入 0.25胰蛋白酶，在 pH8.5，40下酶解数小时
28、， NaOH 调 pH 至 9.0，升温至50，保温 2h，不断搅拌，然后快速升温到 92-95，保持 10-15min，趁热用 80 目滤网过滤，滤液() 备用。 c)取适量强碱性 D254 干树脂，在蒸馏水中充分浸泡，溶胀后滤干，加等体积乙醇或丙酮搅拌 1 小时，用蒸馏水洗净滤干，加 4 倍量的 2mol/l 的盐酸溶液搅拌 2 小时，用蒸馏水洗至中性，滤干；加 2 倍量 2mol/l 的氢氧化钠溶液搅拌 2 小时，蒸馏水洗至中性，滤干；最后用 2 倍量 2mol/l 的盐酸溶液搅拌 2 小时，水洗至中性。 d)取 100g 已处理好的强碱性 D254 树脂加入扩张床柱 Streamlin
29、e50(5cm 内径)、用蠕动泵以每小时 2 倍柱床体积的流速将 pH 为 8.0 的适量 MTris-HCl 缓冲液( )自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡。控制温度 40(平衡) 。 e)将适量滤液 ()加缓冲液( )，配置成料液() 。调整料液( )NaCI 浓度达到 3左右，NaOH 调 pH 至 8.0。用蠕动泵将料液()通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持恒定的 pH 值，温度为 18。流速约为每小时 2.5 倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止(上样) 。 ， f)配制 10 个柱床体积的 6氯化钠溶液，MTris-HCl 缓冲液调节 pH3-5，
30、以 23 个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以 5-6 倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度15-25，流速约为每小时 2.5 柱床体积。( 向上冲洗，除杂 )。 g)关掉蠕动泵，使 D254 树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用用约 4 倍柱床体积的 4氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约 2 倍柱床体积的 3氯化钠溶液(用量先多后少) 同法洗脱 2 次。合并全部洗脱液，调节 pH 为 6(洗脱)。 h)按洗脱液体积加入 1.0 倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。次日吸除乙醇。沉淀物用 2氯化钠溶液溶解，调 pH 至 6.0。按溶液
31、体积加 0.7 倍乙醇，沉淀过夜。 i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得肝素成品。 - -实施例 2 a)将 10g 肝素粗品溶于 3的 100ml 氯化钠溶液中，然后再用 2的氢氧化钠溶液调 pH 至9，于 18静置 6 小时，真空抽滤，滤液待用。 b)在上述清液中加入 0.03胰蛋白酶，在 pH8.5，40下酶解 4 小时，升温 98-100，10min，趁热真空抽滤，滤液() 备用。 c)取适量强碱性 D254 干树脂，在蒸馏水中充分浸泡，溶胀后滤干，加等体积乙醇或丙酮搅拌 1 小时，用蒸馏水洗净滤干，加 4 倍量的 2mol/l 的盐酸溶液
32、搅拌 2 小时，用蒸馏水洗至中性，滤干；加 2 倍量 2mol/l 的氢氧化钠溶液搅拌 2 小时，蒸馏水洗至中性，滤干；最后用 2 倍量 2mol/l 的盐酸溶液搅拌 2 小时，水洗至中性。 d)取 30g 已处理好的强碱性 D254 树脂加入扩张床柱 Streamline50(5cm 内径)、用蠕动泵以每小时 2 倍柱床体积的流苏将 pH 为 8.0 的适量 MTris-HCl 缓冲液( )自柱床底部泵入，使树脂扩张并保持平衡(平衡)。 e)调整 pH 值 9 不变，将适量滤液 ()加缓冲液( )，使粗品氯化钠浓度达到 3左右() 。用蠕动泵将料液()通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过
33、程中保持恒定的 pH 值，保持温度 20。流速约为每小时 2 倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止(上样) 。 f)配制约 10 个柱床体积的预冷的 6氯化钠溶液，用 MTris-HCl 缓冲液调节 pH1.2，缓冲液平衡/扩张柱床后，以 5-6 倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度 5度以下，流速约为每小时 2.5 柱床体积。(向上冲洗) 。 g)关掉蠕动泵，使 D254 树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用用约 4 倍柱床体积的 pH 为 8 的 4氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约 2 倍柱床体积的 3氯
34、化钠溶液(用量先多后少) 同法洗脱 2 次。合并全部洗脱液，调节 pH 为 6(洗脱)。 h)按洗脱液体积加入 1.0 倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。次日吸除乙醇。沉淀物用 2氯化钠溶液溶解，调 pH 至 6.0。按溶液体积加 0.7 倍乙醇，沉淀过夜。 i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得精品肝素。 实施例 3 a)猪、牛、羊等哺乳动物的肝、肺等脏器的组织匀浆液 30g 左右加水至 250L，加入 NaCI至 5，搅拌、静置、过滤。 b)在上述清液中加入 0.4木瓜蛋白酶，在 pH8.5，40下酶解 4 小时，升温 98-100，10分钟，趁热真空抽
35、滤，滤液() 备用。 c)取适量强碱性 D254 干树脂，在蒸馏水中充分浸泡，溶胀后滤干，加等体积乙醇或丙酮搅拌 1 小时，用蒸馏水洗净滤干，加 4 倍量的 2mol/l 的盐酸溶液搅拌 2 小时，用蒸馏水洗至中性，滤干；加 2 倍量 2mol/l 的氢氧化钠溶液搅拌 2 小时，蒸馏水洗至中性，滤干；最后用 2 倍量 2mol/l 的盐酸溶液搅拌 2 小时，水洗至中性。 d)取 100g 已处理好的强碱性 D254 树脂加入扩张床柱 Streamline50(5cm 内径)、用蠕动泵以每小时 2 倍柱床体积的流速将 pH 为 8.0 的适量 MTris-HCl 缓冲液( )自柱床底部泵入，使树
36、脂扩张并保持平衡。控制温度 40(平衡) 。 - -e)将适量滤液 ()加缓冲液( )，配置成料液() 。调整料液( )NaCI 浓度达到 3左右，NaOH 调 pH 至 8.0。用蠕动泵将料液()通进扩张交换柱中反复进行离子交换，交换过程中保持恒定的 pH 值，温度为 18。流速约为每小时 2.5 倍柱床体积，直至流出液检验无肝素，全部吸附在树脂上为止(上样) 。 f)配制 10 个柱床体积的 6氯化钠溶液，MTris-HCl 缓冲液调节 pH3-5，以 23 个沉积床体积的缓冲液平衡/扩张柱床后，以 5-6 倍沉积床体积的缓冲液除杂，整个过程控制温度15-25，流速约为每小时 2.5 柱床体积。( 向上冲洗，除杂 )。 g)关掉蠕动泵，使 D254 树脂重新沉积，调节活塞至刚好在沉积床的表面，然后以向下的液流和沉积床的状态进行洗脱。树脂先用用约 4 倍柱床体积的 4氯化钠溶液进行洗脱，收集洗脱液。再用约 2 倍柱床体积的 3氯化钠溶液(用量先多后少) 同法洗脱 2 次。合并全部洗脱液，调节 pH 为 6(洗脱)。 h)按洗脱液体积加入 1.0 倍量的预冷乙醇，沉淀过夜。次日吸除乙醇。沉淀物用 2氯化钠溶液溶解，调 pH 至 6.0。按溶液体积加 0.7 倍乙醇，沉淀过夜。 i)次日虹吸上清乙醇，取出沉淀物。沉淀物依序用无水乙醇、丙酮洗涤脱水。真空干燥后得肝素成品。 - -
