1、贵州省食品安全地方标准蔬菜中阿维菌素残留的测定 酶联免疫吸附法编制说明（征求意见稿）北京勤邦生物技术有限公司1、任务来源本标准的制定是根据“贵州省重大科技专项计划项目”“贵州省茶叶、蔬菜质量安全评价、检测、预警与可追溯关键技术研究与应用”项目要求而确定的，同时根据贵州省卫生和计划生育委员会办公室关于同意贵州苕粉等 25 项贵州省食品安全地方标准立项的通知（黔卫计办函201594 号）文件的通知要求，我单位承担的茶叶、蔬菜中阿维菌素残留的快速检测 酶联免疫吸附法贵州地方标准于 2015 年 11 月获得立项。2、标准制定的背景和必要性阿维菌素（avermectin，AVMs）是由链霉菌菌株 St
2、rptomyces avermitilis 代谢产生的一组大环内酯类抗生素，具有很高的杀虫活性，被誉为是近 20 年来抗寄生虫药物研究的重大突破。其结构新颖，作用机制独特，对多种农作物的害螨和害虫具有很高的生物活性，是一种优良的抗生素、杀虫剂、杀螨剂，且具有广谱、高效、低残留和对人畜及环境安全等特点。虽然阿维菌素类药物的作用剂量较小（ng/kg 级），但是此类药物的脂溶性高，且具有神经毒性和发育毒性，在动物体内的残留时间长，世界卫生组织（WHO）5 级分类标准中将其列为高毒化合物。世界各国均对蔬菜和水果中的 AVMs 有着严格的限量规定，联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（ FAO/WHO）规
3、定的阿维菌素类药物在水果中的最大残留限量（maximum residue limit，MRL）为 0.010.02mg/L；欧盟规定水果、黄瓜、豆类中的MRL 为 20g/kg；2006 年日本实施的肯定列表制度规定它在农产品中的 MRL 值执行一律标准，即 10g/kg；我国也规定了结球甘蓝、菠菜、普通白菜（小油菜除外）、莴苣、芹菜、大白菜、豇豆的 MRL 为 50g/kg，花椰菜的 MRL 为 500g/kg，小油菜、菜豆的 MRL为 100g/kg，番茄、甜椒、黄瓜的 MRL 为 20g/kg，茄子的 MRL 为 200g/kg。贵州属传统的农业省，农业人口和农业产业比重较大。近年来，我
4、省充分发挥资源优势，加大农业结构调整力度，突出抓好蔬菜、茶叶等优势特色产业。蔬菜面积 1763 万亩，蔬菜已成为我省农业结构调整的支柱产业和农民收入的主要来源。然而随着我省蔬菜产业的不断发展壮大，质量安全也逐渐凸显。茶叶、蔬菜中残留的农药会通过食物链进入人体，危害人类健康，而且农产品会因质量安全问题被进口国（地区）拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同，制约我省的经济发展。因此，加强蔬菜等农产品中阿维菌素等农药的检测和控制是一项刻不容缓的工作。本项目建立阿维菌素的酶联免疫吸附（ELISA）法，采用特异性强的单克隆抗体，检测灵敏度可达到 1g/kg，对蔬菜样本的最低检测限为 5g/kg，满足 FAO/
5、WHO 规定的最大残留限量，样本加标回收率为 70%110%，检测结果准确度高，并且该方法具有特异性强、快速方便、不需要昂贵仪器设备等优点，适合大批量样品的集中快速筛查，可为我省蔬菜等农产品的质量安全监管控制提供技术支撑和重要保障。3、国家标准、行业标准以及其他省外标准的制定发布情况 在国际标准化组织（ISO）标准体系、国际分析化学师协会（AOAC ）标准体系和欧盟标准委员会（CEN）标准体系中，均尚未检索到阿维菌素的检测方法标准；我国标准体系中提供了阿维菌素的检测方法标准 14 项，其中国家标准 10 项（GB/T 20748-2006、GB/T 21319-2007、GB/T 21320-
6、2007、GB/T 21321-2007、GB/T 22953-2008、GB/T 22968-2008、GB 29695-2013、GB 29696-2013、GB 23200.20-2016、GB 23200.19-2016）、农业部公告 3 项（农业部 781 号公告-5-2006、农业部 1025 号公告 -5-2008、农业部 1486 号公告-5-2010）、出入境检验检疫标准 1 项（SN/T 2661-2010），其中仅有 1 项标准适用于蔬菜SN/T 2114-2008 进出口水果和蔬菜中阿维菌素残留量检测方法 液相色谱法。该标准采用的液相色谱法操作繁琐耗时，仪器设备昂贵，且
7、需要专业的技术人员，仅适用于实验室检测，在现场监管检测和企业质量内控工作中有其局限性，不能满足我省对蔬菜农产品中阿维菌素的快速检测需求。4、主要工作过程、主要编制成员、参加成员1、主要工作过程该标准由北京勤邦生物技术有限公司（以下简称勤邦生物）组织专家成立了标准编制工作组，并负责编制起草工作，确定标准的主要技术内容。编制组成立后，进行了广泛的调查和研究工作，主要包括以下几个方面：（1）详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。（2
8、）及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料；已将阿维菌素与羟胺反应得到阿维菌素半抗原；将阿维菌素半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白分别进行偶联得到免疫原和包被原；已将制备获得的抗原通过免疫小鼠获得阿维菌素单克隆抗体；完成抗原抗体筛选、配对，获得最优抗原、抗体稀释倍数组合；建立了酶联免疫吸附法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。（3）针对蔬菜样品与其他参考资料中样品之间的差异，开展多种蔬菜酶联免疫吸附法的试验，包括白菜、胡萝卜，这是方法的重要步骤和关键环节。不同样品用同一种方法进行试验和验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测出蔬菜样品中阿维菌素的含量。如：方法
9、的检测限，对 20 份空白样本进行检测，以检测结果的平均值加上 3 倍标准差来确定检测限；方法的准确率，通过对 5g/kg、10 g/kg、20 g/kg三种浓度添加的蔬菜样本进行检测，得到本检测方法的回收率，盲样测定与仪器方法的结果进行比对，确保本方法的检测结果可靠。（4）在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准样本的格式，起草编写标准文本内容和编制说明内容。2、主要成员、参加成员序号 标准名称 主要编制成员 参加成员1蔬菜中阿维菌素残留的测定 酶联免疫吸附法贵州省农产品质检中心、北京勤邦生物技术有限公司蔡韬、冯才伟、扶胜、陆洋、袁旭、卢平、李占斌、吴小胜、王震、周雪莉、罗华兰、丁静五、标准
10、主要内容确定的依据1、主要技术内容的确定依据技术内容确定的依据：方法的检测限为 5 g/kg，主要是依据我国政府规定的结球甘蓝、菠菜、普通白菜（小油菜除外）、莴苣、芹菜、大白菜、豇豆的 MRL 为 50g/kg，花椰菜的 MRL 为 500g/kg，小油菜、菜豆的 MRL 为 100g/kg，番茄、甜椒、黄瓜的 MRL 为20g/kg，茄子的 MRL 为 200g/kg。本方法的检测限，完全能够符合相关部门的要求。方法的定量限、准确率、特异性等技术指标确定主要依据：一是兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序的规定要求；二是农业部农牧发20031 号文件“关于发布兽药残留试验
11、技术规范（试行）的通知”中的规定要求；三是按照国际食品法典委员会（CAC）通用要求。其他参数、公式、性能要求、实验方法、检验规则等主要依据包括：GB/T1.1-2009 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则(ISO.IEC Directives,Part3,1997,Rules for structure and drafting of International Standard, NEQ)；GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法。2、标准技术内容和技术指标的论证2.1 酶联免疫吸附法主要材料制备2.1.1 半抗原的合成阿维菌素是小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原
12、性，需与大分子载体蛋白共价结合后才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体。本研究先对阿维菌素小分子进行结构改造获得具有羧基官能团的半抗原，与蛋白质分子中的氨基反应，形成肽键，从而可将半抗原与载体蛋白（BSA、OVA 等）偶联制备人工抗原。将阿维菌素与羟胺反应得到具有羧基官能团的半抗原，具体操作如下：阿维菌素与 PDC 在吡啶催化下 60 度反应，氧化糖苷中醇羟基为酮，经提取，纯化得到酮基阿维菌素，在与羟胺缩合反应，得到四碳链长度间隔臂的半抗原产物，经核磁鉴定，结构正确，鉴定图谱如下：图 1 阿维菌素半抗原结构式鉴定氢谱图2.1.2 抗原的合成2.1.2.1 免疫原的合成将阿维菌素半抗原与牛血清白
13、蛋白进行偶联得到免疫原，具体操作如下：取 5mg 阿维菌素半抗原用 1mL DMF 溶解，取 30mg EDC 和 NHS 用 0.2mL 水充分溶解后加入阿维菌素半抗原溶液中，室温下搅拌 24h，即可得到反应液 A；称取 50mg BSA充分溶解在 3.8mL PBS（pH7.2 ）中，将反应液 A 逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌 24h；用 0.01mol/L PBS 于 4透析 3d，每天换液 34 次，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20 保存备用。2.1.2.2 包被原的合成将阿维菌素半抗原与卵清蛋白进行偶联得到包被原，具体操作如下：取 5mg 阿维菌素半抗原用 1mL D
14、MF 溶解，取 30mg EDC 和 NHS 用 0.2mL 水充分溶解后加入阿维菌素半抗原溶液中，室温下搅拌 24h，即可得到反应液 A；称取 50mgOVA充分溶解在 3.8mL PBS（pH7.2 ）中，将反应液 A 逐滴缓慢加到蛋白溶液中，于室温下搅拌 24h；用 0.01mol/L PBS 于 4透析 3d，每天换液 34 次，以除去未反应的小分子物质；分装，于-20 保存备用。2.1.2.3 阿维菌素免疫原与包被原的鉴定方法确定偶联是否成功：一般通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白的偶联是否为有效偶联，因为半抗原与蛋白在紫外下有不同的特征吸收，当偶联成功时，偶联物的紫外吸收会有二者的
15、叠加效应出现，因此比单独的蛋白特征吸收会发生一定的偏移，可用于检测偶联是否成功。偶联比的测定：用纯水稀释阿维菌素半抗原、BSA、OVA 及两种蛋白与阿维菌素半抗原的结合物，配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，得到它们的紫外吸收光谱图。根据公式 K=A/CL 分别计算出阿维菌素半抗原、BAS 、OVA 的摩尔消光系数。在载体蛋白和阿维菌素半抗原的最大波长处检测偶联物的光吸收值，按公式计算两种物质在偶联物中的摩尔浓度比，即偶联比：Ca/Cb =（A 偶 264KBSA280-A 偶 280 KBSA264）/ （A 偶 280K 阿维菌素 264-A 偶 264K 阿维菌素2
16、80）蛋白含量的测定：将偶联物稀释到适当倍数后，测定 280nm 和 260nm 的分光光度值，按公式计算蛋白的浓度即偶联物的浓度：蛋白质（mg/mL）=1.45OD 280-0.74OD260免疫原和包被原的鉴定结果：将阿维菌素半抗原、载体蛋白以及两者的结合物配制成一定浓度的溶液，然后用紫外分光光度计进行全波长扫描，经过计算分析得到人工抗原的结合比和浓度。阿维菌素-BSA 和阿维菌素-OVA 结合比分别为 6:1 和 8:1。2.1.3 抗体的制备2.1.3.1 动物免疫以阿维菌素-BSA 作为免疫原，免疫雌性 BALB/c 小鼠（810 周龄）。免疫方案如下：首免时，每只小鼠用 150 g
17、 的阿维菌素-BSA（以载体蛋白计）与 FCA 按 1:3 比例混合制成的乳化剂，颈背部皮下多点注射；二免和三免时，将 FCA 换成 FICA，剂量和方法同上。每次免疫间隔时间为 2 周。融合前 3 天每只小鼠腹腔注入 100 g 阿维菌素-BSA 进行加强免疫。2.1.3.2 单克隆抗体的制备 三免后第 7 天，采血清测效价。效价达 1.6105 以上的小鼠于四免后第 12 天，摘除眼球放血，并分离阳性血清作对照。无菌操作取小鼠的脾细胞与 SP2/0 细胞融合（比例数8:1）。融合剂为聚乙二醇（ PEG）4000，作用 2 min，随后即加入 20 mL 无血清的 1640 营养液（时间 4
18、 min）。离心后，用 20 mL 完全营养液悬浮混匀。将细胞悬液分别加入已铺有饲养细胞的 96 孔细胞培养板中（4 板），0.1 mL/孔置 37 饱和湿度、含 5%CO2 的培养箱中培养。待细胞长至孔底的 1/21/3 时，用间接竞争 ELISA 方法筛选。阳性细胞迅速扩大培养并采用有限稀释法进行亚克隆。1014 天后，取细胞上清检测，计算阳性率。阳性率 100%时，得到稳定的细胞株。采用体内诱生腹水法进行大量单克隆抗体的制备，将 BALB/C 小鼠（68 周龄）腹腔注入灭菌石蜡油 0.5 mL/只，10 天后，再注入阳性细胞 1106 个/只，植入细胞后第 7 天起，每天观察小鼠腹部，待
19、小鼠腹部明显膨大，用 9#针头穿刺腹腔抽取腹水。每只小鼠可采腹水约 23 mL/次。离心去脂肪层和细胞层后，用饱和硫酸铵法纯化，分装冻存。阳性细胞经过 3 次亚克隆，阳性率达 90%，得到了 2 株稳定分泌单克隆抗体的细胞。2.2 检测方法的建立2.2.1 抗原、抗体的筛选1）用常规包被液（pH9.6，0.05mol/L 的碳酸盐缓冲液）将 1#、2#、3#抗原分别进行1:2104、1:410 4、1:810 4 稀释，包被酶标板 100L/孔， 37恒温避光反应 2h，PBST 洗液洗涤 1 次，用常规封闭液（pH7.2 ，含有 5%卵清蛋白， 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液）封闭，37恒温
20、避光反应 2h，甩干；2）向板孔中加入标准品溶液（浓度为 1g/L的阿维菌素） 100L；3）加入用常规抗体稀释液（pH7.2 ，含有 8%牛血清白蛋白， 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液）稀释 1:4105， 1:6105，1:810 5 的 1#、2#酶结合抗体工作液各 100L，振荡混匀，25避光反应 30min，用 PBST 洗液洗板 3 次；4）加入底物 A 液和 B 液各 50L，25反应 20min，加入 50L终止液终止；5）按以上操作方法，分别测定零标准品 OD 值及 1g/L标准品的 OD 值，计算抑制率，以零标准品 OD 值为 1.52.0，1g/L 标准品抑制率为 70%
21、80%作为评定标准，选择较好的抗原抗体组合和抗原抗体工作浓度见表 1（a）（b） 。表 1（a ）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中 W 表示 1104）1#抗原 2#抗原 3#抗原抗体稀释倍数检测项目 1:2W 1:4W 1:8W 1:2W 1:4W 1:8W 1:2W 1:4W 1:8W0g/L标准品OD 值2.442 1.974 1.417 2.902 2.505 2.102 2.164 1.858 1.5421g/L标准品OD 值2.295 1.717 1.204 2.670 2.380 1.766 1.796 1.616 1.480 1:40W抑制率（%）94 87
22、85 92 95 84 83 87 960g/L标准品OD 值1.663 1.438 1.195 2.612 2.294 1.986 1.876 1.653 1.3841g/L标准品OD 值1.430 1.222 1.099 2.429 1.996 1.728 1.613 1.438 1.163 1:60W抑制率（%）86 85 92 93 87 87 86 87 840g/L标准品OD 值1.394 1.161 0.974 2.105 1.701 1.517 1.614 1.408 1.1791g/L标准品OD 值1.213 1.103 0.964 1.768 1.446 1.350 1.3
23、40 1.197 1.073 1#抗体1:80W抑制率（%）87 95 99 84 85 89 83 85 91表 1（b）方阵法确定最佳的抗原、抗体及最佳的工作浓度（表格中 W 表示 1104）1#抗原 2#抗原 3#抗原抗体稀释倍数检测项目 1:2W 1:4W 1:8W 1:2W 1:4W 1:8W 1:2W 1:4W 1:8W0g/L标准品OD 值2.806 2.493 2.074 1.953 1.702 1.376 2.017 1.736 1.4441g/L标准品OD 值2.413 2.343 1.763 1.641 1.498 1.293 1.795 1.510 1.199 1:40
24、W抑制率（% ）86 94 85 84 88 94 89 87 830g/L标准品OD 值2.484 1.946 1.698 1.619 1.455 1.263 1.634 1.418 1.1971g/L标准品OD 值2.260 1.635 1.460 1.360 1.237 1.086 1.340 1.106 1.017 1:60W抑制率（% ）91 84 86 84 85 86 82 78 850g/L标准品OD 值2.179 1.756 1.375 1.438 1.130 0.907 1.123 0.922 0.6281g/L标准品OD 值1.787 1.335 1.141 1.265
25、0.938 0.825 0.921 0.774 0.421 2#抗体1:80W抑制率（% ）82 76 83 88 83 91 82 84 67由表 1（a）（b）可知，1#抗原 1:4104 稀释，2#酶结合物抗体工作液 1:8105 稀释时，零标准品 OD 值在 1.52.0 之间，1g/L 标准品抑制率为 76%，符合要求。2.2.2 反应温度确定1）包被抗原：用常规包被液将 1#抗原进行 1:4104 稀释，包被酶标板 100L/孔，37恒温避光反应 2h，用 PBST 洗液洗涤 1 次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应 2h，甩干；2）加样方式：向板孔中加入标准品溶液 100L、用
26、常规抗体稀释液稀释 1:8105 的 2#酶结合物抗体 100L，混匀，分别在 25、37 下避光反应 30min，用 PBST 洗液洗板 3次；3）加入底物 A 液和 B 液各 50L，25反应 15min，加入 50L终止液终止；4）按照以上操作方法，分别测定零标准品 OD 值、1g/L 标准品 OD 值、空白白菜样本 OD 值，计算抑制率，以零标准品 OD 值为 1.52.0，空白蔬菜样本 OD 值接近零标准品OD 值，抑制率在 70%80%为判定标准，选择较好的反应温度（见表 2）。表 2 反应温度的确定试验反应温度 零标准品 OD 值 1g/L标准品 OD 值抑制率（%）空白白菜 O
27、D 值25 1.812 1.315 73 1.71437 2.003 1.825 91 1.842由表 2 可知，25条件下，加入 100L 标准品溶液、100L 酶结合物抗体工作液反应后，测定的零标准品 OD 值在 1.52.0 之间，1g/L 标准品的抑制率在 70%80%之间，空白蔬菜样品的 OD 值与零标准品 OD 值偏差较小。2.2.3 抗原、抗体反应时间确定1）包被抗原：用常规包被液将 1#抗原进行 1:4104稀释，包被酶标板 100L/孔，37恒温避光反应 2h，用 PBST 洗液洗涤 1 次，用常规封闭液封闭，37恒温避光反应2h，甩干；2）加样方式：向板孔中加入标准品溶液 100L、用常规抗体稀释液稀释 1:8105的2#酶结合物抗体工作液 100L，混匀，分别在 25下避光反应 15、30、60min，用 PBST洗液洗板 3 次；3）加入底物 A 液和 B 液各 50L，25反应 20min，加入 50L 终止液终止；4）按照以上反应方式，测定零标准品 OD 值，重复两次，每次做 6 个对照孔，计算不同反应时间测定值的变异度 CV%（见表 3）。表 3 抗原、酶结合物抗体反应时间确定测定项目 抗原、酶结合物抗体反应时间（ min）
