1、酶在水产品加工副产物综合利用中的应用1 前言1.1 水产品现状中国是渔业发展大国，拥有丰富的淡水资源和海洋资源，我国水产品总产量占，世界的1/3以上。据全国20个渔业主产省统计月报数据，2014年16月全国水产品产2616.38万t,同比增长3.40%，其中养殖产量2030.50万t，同比增长4.43%，捕捞产量585.88万t，同比下降0.03%,远洋渔业1季度总产量47.66万t，同比增长64% 1。2013年水产品出口额首次突破200亿美元，再创历史新高，连续12年居全球首位。据中国海关统计，2013年中国水产品出口量395.9万t，出口额202.6亿美元，同比分别提高4.2%和6.7%
2、；进口量417.0万t，进口额86.4亿美元，同比分别提高1.1%和8.0%。贸易顺差116.3亿美元，较上年同期提高5.8 个百分点。水产品出口平均价格上涨2.5%，进口平均价格上涨6.8% 2。但是我国在水产品加工和综合利用仍然存在基础薄弱、利用率低、附加值不高和管理体系落伍等很多问题,与世界水平差距明显 3。资料显示,世界水产品产量的 70%以上是经过加工后销售的，而我国 2011 年的加工比例占产量的比重不到 40%,加工能力利用率只有 80%4。1.2 水产品副产物加工在加工过程产生的副产物约占鱼体总重的一半以上 5。这些副产物含有丰富的营养物质和功能性成分。通常这些副产物加工利用程
3、度很低，如果不充分利用这些加工副产物，会造成资源浪费和环境污染。高效合理地利用这些副产物是体现一个国家加工水平的一个重要方面。1.3 酶在食品工业的应用酶是活细胞产生的具有催化功能的生物催化剂，它参与生物体内一切生物化学反应过程 6。近 50 年来酶科学得到了飞速的发展。目前，人类发现的酶已经超过 5000 种，工业化生产的酶制剂有近 200 种，常用的有 30 多种 7。酶工程是生物技术的一个重要组成部分，指在一定的生物反应器内，利用酶的催化作用，进行物质转化的技术。酶工程包括自然酶的开发及应用，固定化酶、固定化细胞、多酶反应器(生物反应器) 、酶分子的修饰改造及酶传感器等，广泛应用于食品加
4、工的许多领域。随着渔业资源的衰退，水体污染和过度捕捞，低值水产品比例不断上升，水产加工下脚料也无法得到有效利用，利用一些低值鱼来生产高附加值的产品已显得越来越重要，而酶技术在水产品加工中的应用正好解决了这一难题，为水产品加工业开辟了一条发展新路子。随着酶技术和水产品加工业的不断发展，酶在水产品加工中也得到了广泛的应用 8。酶制剂是从生物中提取的具有酶特性的一类活性物质。在水产品加工业方面，研究人员对蛋白酶的研究最为深入，通过蛋白酶处理低值水产品和加工下脚料，可提高生产效率和产品质量，降低环境污染，丰富水产品市场 9。2 酶在水产品副产物综合利用中的应用2.1 酶在梭子蟹下脚料综合加工技术的研究
5、2.1.1 酶法提取梭子蟹下脚料中的蛋白质陶学明 10采用酶法从脱脂后的梭子蟹下脚料中提取蛋白质,并加工成蛋白粉，首先从多种备选蛋白酶中筛选出最适的水解蛋白酶，采用筛选出的蛋白酶对梭子蟹下脚料进行单酶水解，以水解度为评价指标，分别研究加酶量、pH 值、温度、液料比、时间等因素对梭子蟹下脚料水解效果的影响,并通过正交试验获取最佳的单酶水解条件;最佳条件下获取的蛋白水解液经喷雾干燥加工成蛋白粉,并对其的质量进行分析。(1)脱脂蟹下脚料中蛋白质含量为 25.76%，脂肪 0.24%，水分 4.62%，灰分49.58%。(2)酶活力测定结果:中性蛋白酶 15.47 万 u/g，碱性蛋白酶 10.05
6、万 u/g，木瓜蛋白酶 10.65 万 u/g，风味蛋白酶 10.04 万 u/g，复合蛋白酶 10.38 万u/g，胰蛋白酶 16.21 万 u/g。(3)六种蛋白酶对梭子蟹下脚料的水解能力大小顺序为：碱性蛋白酶中性蛋白酶风味蛋白酶复合蛋白酶胰蛋白酶木瓜蛋白酶，梭子蟹下脚料的最佳水解蛋白酶为碱性蛋白酶。(4)梭子蟹下脚料碱性蛋白酶水解的最优水解条件为：液料比 3:1，时间3.oh,温度 55，pH5.5，加酶量 l000u/g，各因素对水解度的影响程度依次为：温度加酶量pH 值时间，其中温度为显著性因素。(5)提取放大试验结果表明,随着投料量的增加，水解度、得率和氮回收率均有不同程度的减少,
7、其中水解度下降 17.25%，得率和氮回收率下降 12.53%，得率和蛋白回收率较为稳定,表明水解工艺是可行的。(6)梭子蟹下脚料蛋白水解物中氨基酸含量丰富,氨基酸总量为lo46.7mg/L，8 种必需氨基酸齐全,含量为 382.5mg/L，占氨基酸总量的36.54%，而 Glu、Gly、AsP 及 Ala 等 4 种主要呈味氨基酸含量非常丰富，为412.6mg/L,占氨基酸总量的 39.42%。(7)梭子蟹下脚料的蛋白水解物经喷雾干燥后得到梭子蟹蛋白粉,其呈淡黄色粉末，具有醇厚的蟹香味，冲溶后口感微苦，蟹味浓郁；分子量低于IOkDa；蛋白质含量 72.23%，脂肪仅 0.12%，水分 5.1
8、8%，灰分 12.58%，除蛋白质和灰分含量外，其余各项指标均达到 QB2732-2005 水解胶原蛋白的行业标准。2.1.2 复合酶法从脱脂梭子蟹下脚料中制备蛋白水解物采用复合酶法从脱脂梭子蟹下脚料中制备蛋白水解物,并将其加工成海鲜调味汁，在单酶筛选的基础上,通过组合试验选出最适的复合酶，采用复合酶对梭子蟹下脚料进行水解,分别研究时间、温度、pH 值、加酶量、液料比、酶的复合比等因素对梭子蟹下脚料水解效果的影响,并通过正交试验获取最佳的复合酶水解条件，最佳条件下获取的蛋白水解液经过浓缩后加工成海鲜调味汁,试验以色泽、香气和滋味为评价指标,采用正交试验确定海鲜调味汁的最佳配方,并对产品的质量进
9、行分析。分析研究梭子蟹下脚料蛋白水解物的功能特性及抗氧化活性“其中功能特性的研究内容包括溶解性、吸水性、吸油性、乳化性及乳化稳定性、起泡性及泡沫稳定性等，抗氧化活性的研究内容包括梭子蟹下脚料蛋白水解物的还原力、清除轻基自由基能力和清除超氧阴离子自由基能力等,并对水解物的基本成分和色泽进行分析。(1)试验中的三种复合酶的水解能力均大于单一的碱性蛋白酶，梭子蟹下脚料最适的水解蛋白酶为中性+风味的复合酶。(2)梭子蟹下脚料复合酶水解的最佳条件为:酶的复合比 2:1，液料比 3:1，温度 50e，pH 值 7.0，加酶量 1200u/g，时间 3.0h。各因素对水解效果影响的大小顺序为：A(温度)B(
10、pH 值)D(时间)c(加酶量),其中温度和 pH 值为显著性因素“(3)梭子蟹下脚料蛋白水解液中氨基酸总量为 1395.Omg/L，8 种必需氨基酸为 496.7mg/L，占总量的 35.61%，4 种呈味氨基酸总量为 554.9mg/L，占总量的39.78%，赋予水解液浓郁的海鲜风味，水解液的苦味淡。(4)海鲜调味汁最佳配方为:食盐 10%，白砂糖 5%，味精 5%，姜粉 0.2%，变性淀粉 1.0%，产品具有海鲜调味汁特有的色泽、香气和滋味,理化指标和微生物指标均能达到 DBn517-2008 液态调味品卫生要求中的相关规定。(5)由国家农副加工食品质量监督查验中心和国家农业标准化与检测
11、中心(安徽)出据的检测报告表明：海鲜调味汁达到 GB10133-2005 水产调味品卫生标准。2.2 碱性蛋白酶酶解扇贝裙边制备抗菌肽近 20 年来，国内外报道了大量关于酶解贝类蛋白及其酶解物功效方面的研究。曾名勇 11通过酶解太平洋牡蛎获得了具有抑菌作用的抗菌肽。抗菌肽是一类广泛存在于生物体中具有抗菌活性的小分子多肽，是生物体自身防御系统的一部分，具有小分子量(12 100 个氨基酸残基)、热稳定(大部分在 100高温下加热 10min 仍保持一定活性)、抗菌谱广、不产生抗药性等特点，大约已有 500多种抗菌肽被分离鉴定。在当前抗生素滥用导致许多致病菌产生抗药性的背景下，抗菌肽以其自身特点为
12、解决抗药性提供了一条新的途径。目前获得抗菌肽的途径主要有 3 种：从自然生物中提取、采用合成方法制备和酶解。前 2 种方法获得抗菌肽的来源比较有限，而酶解技术成本低、安全性好，并可以大规模生产。通过酶解技术酶解扇贝裙边获得抗菌肽，一方面可以做到资源的综合利用产生经济效益，另一方面也扩大抗菌肽的获得渠道，即海洋蛋白来源的抗菌肽。2.2.1 酶解紫贻贝获得抗菌肽研究宋宏霞 12根据酶的水解特性和有关文献，选择 Bromelain、Alcalase 蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶五种酶进行单酶水解实验即先 Alcalase蛋白酶的水解条件进行酶解，然后调节至 Bromelain 水解的最佳条
13、件，进行复合酶解，另一种方式是先按照 Bromelain 的水解条件进行酶解，然后调节至Alcalase 蛋白酶的条件进行水解，并与两种酶的最佳水解方式进行比较，确定最佳复合酶解工艺条件。通过采用 Alcalase 蛋白酶，再用 Bromelain 酶的复合酶解方式从紫贻贝中酶解得到粗抗菌肽，MIC 值 15.312-61.25g/mL 之间，该肽对革兰阳性菌的抑制作用要大于对革兰阴性菌的抑制作用，具有较广的抗菌谱，分子量约为2490u。并研究了该肽在草莓保鲜和鲈鱼防腐中的作用。2.2.2 蛋白酶酶解紫贻贝研究刘尊英 13等用蛋白酶酶解紫贻贝，选择 4 种酶的酶解条件和酶解物的抑菌效果如表 1
14、 所示，从对 Botryis cinerea 的抑制率来看，胰蛋白酶酶解物的抗菌活性最高, 其抑菌率分别比胃蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶酶解物高38.4%、19.5%和 18.2%，差异达显著水平(P0.01)。贻贝胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶酶解产物均有一定的抗菌活性, 其中胰蛋白酶酶解产物抗菌活性最强, 其最佳酶解条件为 55、pH8.5、加酶量 300U/g、时间 2h、料水比 11。其中胰蛋白酶酶解液对于病原菌 Botryis cinerea 的抑菌率达 67. 9%以上。2.3 鱿鱼加工副产物水解蛋白的制备及抗氧化活性研究食品中脂质易发生过度氧化,产生异味、臭味和潜在
15、的毒性物质等不良后果；人体内自由基水平失衡时，过量的自由基对机体产生氧化损伤，产生许多退行性疾病，而天然抗氧化剂有助于维持机体自由基平衡和延迟食品中脂质过氧化的发生,且无毒副作用，通过对鱿鱼加工副产物酶水解物的制备和抗氧化性研究，制备天然抗氧化活性肤成分,具有理论意义和应用价值。2.3.1 鱿鱼加工副产物水解蛋白的制备谢宁宁 14从鱿鱼加工副产物边角料和鱼皮中分别制备出鱼肉蛋白粉和明胶,提取率分别为 15.26%和 5.94%。采用五种蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶)，分别水解这两种蛋白,筛选清除 DPPH 和经自由基活性最高的水解物,结果表明：木瓜蛋白酶水解鱼
16、肉蛋白粉 30min 时，1.5mg/mL 水解物的 DPPH 和轻自由基清除率最高,分别为 59.51%和 57.58%,这两项指标均高于鱿鱼皮明胶的水解物。运用单因素实验结合响应面法优化木瓜蛋白酶水解鱼肉蛋白粉的酶解工艺，以水解物的 DPPH 自由基清除率为指标，制备高活性的水解物，最终确立了最佳水解条件为：pH 值 7.0，底物浓度 4%，酶底物比 1.74%，反应温度 51，时间46min:在 99%置信区间内,实际值(74.40%)和理论值(74.25%)拟合良好，模型误差较小，所制备的鱼肉蛋白水解物 OSMH 的 DPPH 清除率提高了 24,77%。2.3.2 鱿鱼加工副产物水解
17、蛋白抗氧化活性研究对鱿鱼加工副产物水解物的活性氧清除率、还原能力、金属离子鳌合率和抑制脂质自氧化能力进行研究，结果表明：当 OSMH 的浓度为 1.5mg/mL 时，其羟自由基(OH)、超氧阴离子(0 2)和过氧化氢自由基(H 2O2)，清除率分别为72.41.21%，54.9576%和 48.711.16%，当浓度为 10mg/mL 时,其还原能力强于 0.01mg/mLBHT 和 0.1mg/mLVE，浓度为 8mg/mL 和 10mg/mL 时，其 Fe2+鳌合能力分别为 28.940.71%和 30.190.63%，当浓度为 8mg/mL 时,其抑制脂质自氧化效果优于 0.1mg/mL
18、VE。采用超滤、离子交换色谱、凝胶色谱、AKTA purifier 系统和反相高效液相色谱技术,以 DPPH 自由基清除率为活性检测指标，分离出高抗氧化性组分，经 Waters platform ZMD 4000 质谱仪分析和 Biolynx 软件处理,获得两种抗氧化肤，分别为 proGluTrp(430.18Da)和 SerSerLeuAlaGlyPro(530.27Da)。2.4 鲢鱼鱼麟胶原蛋白肽的制备及其抗氧化活性的研究鲢鱼由于其生长速度快,易养殖,营养价值高,已成为我国一种主要的淡水鱼,其加工过程中产生的大量副产物(如鱼头、鱼皮、鱼鳞、鱼骨及内脏等)通常都被当做废弃物而丢弃。而鱼鳞中
19、蛋白质占其总重的 50%-70%,且主要为胶原蛋白和角蛋白,因而鱼鳞是非常好的胶原蛋白生产原料。利用鱼鳞生产胶原蛋白,既可以保护环境,又显著提高水产品加工附加值 15。2.4.1 鲢鱼鱼麟胶原蛋白肽的制备陈日春 16为获得较高的鲢鱼鱼鳞胶原蛋白提取率，首先对鱼鳞进行脱钙处理，通过单因素试验摸索和正交试验设计优化得到最优的脱钙工艺条件为：料液比 1:30，EDTA 浓度 0.17mol/L，浸泡时间 30h，在此最优条件下，鲢鱼鱼鳞的脱钙率为 94.11%。采用响应面试验设计对胃蛋白酶提取鲢鱼鱼鳞胶原蛋白的工艺条件进行优化，得到最优提取条件为：液料比(v/w) 18.0,胃蛋白酶添加量提取时间
20、61.9h，在该最优条件下提取率为 4.020.11%。2.4.2 设计优化蛋白提高酶鲢鱼鱼麟胶原蛋白肽抗氧化活性采用响应面试验设计优化碱性蛋白酶制备鲢鱼鱼鳞胶原蛋白抗氧化活性肽的条件，得到最优的制备条件为底物浓度 5.47%，酶解时间 4.24h，酶添加量42001Ug-1在该条件下，所得抗氧化肽对 DPPH、0 2-和OH 自由基清除率分别为 79.620.1.04%、46.280.96%和 63.470.88%，与优化前比较,抗氧化肽对各自由基的清除率得到显著提高(P0.05)。2.5 酶法利用罗非鱼加工废弃物生产鱼鲜酱油2.5.1不同蛋白酶对罗非鱼加工废弃物的水解效果吴燕燕 17等研究
21、选用木瓜蛋白酶，Alcalase、Neutrase、Protamex、Flavourzyme、菠萝酶对罗非鱼加工废弃物进行水解，以游离氨基酸态氮含量和风味为评价指标，固液比(下脚料与去离子水质量比)为1：1，酶的加量为2000U g -1,在各酶相应的最适作用条件下水解4h，其最适作用条件根据初步试验确定，加热灭酶5min，4200r/min -1，离心15min，取上清液分别进行氨基酸态氮含量测定和风味评价,结果下表：2.5.2 几种双酶复合水解效果分析由于 Flavourzyme 包含有内切肽酶和外切肽酶 2 种活性，可以脱除低水解度底物苦味蛋白水解液的苦味，根据文献报道，其能改善鸡肉水解
22、物的风味，水解液无苦味，这在单酶水解条件下也得以证实，故将 Flavourzyme 作为改变酶解液风味和增加水解度考虑，与其它酶混合水解。由菠萝酶与 Flavourzyme混合水解的效果比其它酶与 Flavourzyme 混合水解的效果好，而菠萝酶先加入水解一段时间再加入 Flavourzyme 继续水解,结果比这 2 种酶同时加入水解效果更好，所以采用先加入菠萝酶，后加入 Flavourzyme 的混合酶水解效果好。3 展望水产加工业是渔业生产的延续，是优化渔业结构、实现渔业增效、渔农增收的有效途径。我国水产加工业已发展成为以冷冻冷藏水产品为主，鱼糜制品、调味休闲食品、干制品、腌熏制品、罐头
23、制品、调味品、功能保健品、鱼粉与饲料加工、海藻化工、海藻食品以及海洋药物等多个门类为辅的较为完善的水产加工体系。但整体来说，我国水产品加工与国外水平相比，还有很大的差距，主要表现为：加工量比例较低、加工技术含量低,高附加值产品少、废弃物综合加工利用水平不高 18。酶技术应用于水产品副产物的综合利用具有极高的经济效益、社会效益和环境效益。拥有自主知识产权的生产技术投入使用，大大提高企业的竞争力，减少对外依存度，节省大量外汇和原料进口风险。水产在居民消费中占据很大比重，水产品消费总量仍将不断增加，商品性消费日益取代自给型消费，工业化水产品副产物比重逐步增长，为酶技术及水产品副产物加工业发展提供巨大
24、的市场空间。利用酶技术发展农产品副产物加工业，符合社会发展需求变化，具有广阔前景。环境方面，既避免了污染，保护了环境，又真正实现了无渣无害化生产，合理延长产业链 19。4 参考文献1袁晓初.2014 年上半年渔业经济形势分析N.中国渔业报，2014-08-05（1）.2刘景景. 2011 年我国水产品市场形势分析与展望J. 农业展望, 2012, (2).3柏芸,熊善柏.我国淡水鱼加工业现状,问题与对策.湖北农业科学,2010,49 (12) : 3159-31614王希搏. 鱼鳞有机酸钙、胶原蛋白及胶原多肽联产工艺与工厂设计D. 华中农业大学, 2013.5岑剑伟,李来好,杨贤庆,陈胜军,郝
25、淑贤.我国水产品加工行业发展现状分析.现代渔业信息,2008, 23 (7): 6-9.6杨华，娄永江，吴祖芳，等. 酶技术及其在水产品精深加工中的应用与展望. 食品研究与开发，2004，25(1)：29-31. 7付万冬,杨会成,李碧清,钟明杰.我国水产品加工综合利用的研究现状与发展趋势.现代渔业信息,2009, 22 (12): 3-5.8Jianrong Li,Haixia Lu,Junli Zhu,Yanbo Wang,Xuepeng Li. Aquatic products processing industry in China: Challenges and outlookJ.
26、Trends in Food Science & Technology. 2008 (2).9王龙，叶克难水产蛋白资源的酶解利用研究现状与展望J. 食品科学，2006，27(12)：807-812.10陶学明. 梭子蟹下脚料综合加工技术的研究D. 合肥工业大学, 2009.11曾名勇 M Z, 崔文萱 W C, 赵元 Y Z等. Antiviral active peptide from oysterJ. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2008, 26:307-312. 12宋宏霞. 紫贻贝抗菌肽的研究D. 中国海洋大学, 2007.
27、13刘尊英, 董士远, 曾名勇等. 紫贻贝酶解产物抗菌活性及其工艺优化研究J. 食品科技, 2007, (2):145-147.14谢宁宁. 鱿鱼加工副产物水解蛋白的制备及抗氧化活性研究D. 浙江海洋学院, 2010.15钟朝辉,李春美,梁晋鄂,等.鱼鳞胶原蛋白提取工艺的优化J.食品科学,2006,27(7):162-165.16陈日春. 鲢鱼鱼鳞胶原蛋白肽的制备及其抗氧化活性的研究D. 福建农林大学, 2013.17 吴燕燕, 李来好, 岑剑伟等. 酶法由罗非鱼加工废弃物制取调味料的研究J. 南方水产, 2006, (1):49-53.18倪瑞芳, 胡骏, 王开洋. 水产品加工副产物的综合利用J. 河北渔业, 2010, (8):47-50.19曾峰, 赵坤, 韩伟伟等. 食品生物技术在农产品副产物综合利用中的应用J. 食品科学, 2011.
