1、CAR-T基础知识向莉伟 CAR-T细胞部2017.07.27导言：CAR-T（嵌合抗原受体 T细胞）药物是一种有生命的药物，原理在于经 嵌合抗原受体 修饰的 T细胞，可以特异性地识别 肿瘤相关抗原 ，使效应 T细胞的 靶向性、杀伤活性和持久性 均较常规应用的免疫细胞高，从而发挥抗癌作用。 CAR-T细胞疗法在早期的临床试验中并没有表现出惊人的疗效，然而随着抗 CD19 CAR-T细胞疗法在 B细胞恶性肿瘤中显示出的巨大潜力， CAR-T产品一时间成了抗肿瘤领域的新星。什么是 CAR-T细胞 嵌合 抗原受体（ chimeric antigen receptor, CAR） T细胞技术 ； 是
2、过继细胞免疫治疗（ adoptive cellular immunotherapy， ACI)的一种 ； 通过 基因改造技术， 让患者 T细胞 表达嵌合抗原受体，使效应 T细胞的靶向性、杀伤性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服 肿瘤局部免疫抑制微环境 和打破宿主免疫耐受状态 ； 是 一种特异性的免疫细胞抗肿瘤治疗。T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起重要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。对 T细胞进行基因工程处理，从而在其表面表达能够识别特异性肿瘤抗原的特殊受体称为 嵌合抗原受体（ CAR），同时在受体的胞内段可加上引起 T细胞活化的信号传递区域。肿 瘤 对 患者的免疫系 统
3、 具有抑制作用，限制了自身免疫功能的 诱导 和激活，因此可以把患者的免疫 细 胞放到一种可以避开 肿 瘤抑制因素的 环 境中 进 行激活和 扩 增，然后再将 扩 增后的免疫 细 胞回 输 患者，从而使患者的免疫功能迅速增 强 ，达到 杀伤肿 瘤 细胞的作用， 这 种 疗 法就是 过继 性免疫 疗 法 CAR-T技术原理 ： 嵌合抗原受体（ CARs）是由一个 胞外抗原识别域 （通常是一个单链抗体，也可以是多肽或者其他蛋白质）和 一个胞内信号域 组成。 CAR的 胞外部分 用来 识别特异性的肿瘤抗原 ，随后 胞内信号域 会 刺激 T细胞增殖 ，并且通过 细胞溶解 和 细胞因子 释放来消除肿瘤细胞
4、。 第一代 CARs的胞内信号域是 CD3 信号链（ signal 1），这一代产品在临床试验中效果有限，可能由于移植 T细胞的活化诱导细胞死亡（ AICD）或者 T细胞扩增的持续性不好所导致。 第二代 CARs相比第一代 CARs增加了一个胞内共刺激信号域 （ signal 2）。在过去的5年里，对于第二代含有 CD28或者 4-1BB(CD137) 共刺激信号域的抗 CD19 CAR-T，在治疗 B淋巴细胞白血病 的临床试验中都表现出优异的疗效，但是仍然需要寻找 更好的共刺激信号分子 ，来解决第二代 CAR-T产品作用不持久等问题。 第三代 CARs不仅包含 CD3 信号域，还包括 两个共
5、刺激信号分子 （图 1），这些共刺激信号分子主要包括 CD28、 4 -1BB以及 OX40 (CD134)等，在临床前研究中发现第三代 CAR-T细胞疗法效果要优于第二代产品CAR构成（ 1） -scFV（单链抗体）识别肿瘤表面抗原特异性CAR构成（ 2） -TCR/CD3/产生信号，激活 T淋巴细胞有效性CAR构成（ 3） - co-stimulator 增殖与存活加入 CD28，产生 IL-2等加入 CD137（ 4-1BB），增强多种能力CD28是 T细胞表面的一个蛋白，能够为 T细胞提供共刺激信号 ，对 T细胞的 活化和存活 具有重要作用。 T细胞刺激信号通过 CD28，能够促进多种
6、白介素的分泌。CD137，又被称作 4-1BB、 TNFRSF9等，它是 TNF受体家族成员。 CD137表达于活化后的 T细胞，也表达于树突细胞，滤泡树突状细胞、 NK细胞、粒细胞以及炎症位置的血管壁细胞等。CD137可以作为共刺激信号激活 T细胞，能够增强 T细胞的增殖、存活能力、细胞裂解作用以及 IL-2分泌等。CAR-T细胞的发展过程第一代 CAR-T细胞 发表时间： 1989年； 嵌合受体的形成方法： Eshhar研究小组将免疫球蛋白样 scFv和 FcRI受体 (链 )或 CD3复合物 (链 )胞内结构域融合形成嵌合受体； 激活方式：表达 CAR的 T细胞以抗原依赖、非 MHC限制
7、的方式结合肿瘤抗原 , 启动并活化特异性杀伤肿瘤反应； CARs表达的稳定性依赖于所用的胞内信号域； 大多数试验在细胞扩增、体内存活时间、细胞因子分泌等方面存在不足，治疗效果不明显。CAR-T细胞的发展过程第二代 CAR-T细胞 发表时间： 2010年； 嵌合受体的形成方法： T细胞的完全活化有赖于双信号 *和细胞因子的作用。因此，依照 T细胞活化的双信号学说 , 第二和第三代 CARs 在嵌合受体上加上如 CD28、CD134(OX40)和 CD137(4-1BB)等共刺激分子 (costimulatory molecule, CM)，以提高 T细胞的细胞毒性、增殖活性 , 维持 T细胞应答
8、 , 延长 T细胞存活时间等（图 2）； CD28、 CD134对提高初始 T细胞获得持久的体外增殖和较强的细胞因子分泌非常重要 ； 在治疗慢淋中观察到：体内扩增 1000倍以上 ,而且在血液和骨髓中存活的时间也超过 6个月 , 分泌的细胞因子如干扰素 -、 CXCL9等较治疗前显著增高。T细胞激活需要双信号第一信号为 特异性信号 , 由 TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽 -MHC复合物所启动 ; 第二信号为 协同刺激信号 , 通过CD28/B7等重要的共刺激分子 , 促进IL-2合成 , 并使 T细胞充分活化及免于凋亡。CAR-T细胞的发展过程第三代 CAR-T细胞发表时间： 2012年；
9、嵌合受体的形成方法： 以逆转录病毒为载体构建第三代 CAR-T细胞 (scFv CD20-CD28-CD137-CD3）；两个共刺激因子，进一步提高细胞增殖能力及细胞毒性患者输注后 4小时血液就检测出有高水平的 IFN-、 GM-CSF、 TNF-和 IL-6等细胞因子；效应细胞在体内存活的时间超过 12个月；由于目前第三代 CAR-T细胞临床应用还比较少 , 故其安全性和有效性是否就一定优于第二代 CAR-T细胞 , 以及选择怎样的共刺激分子组合 , 还需进一步观察。2nd 病毒载体的 转移效率高 , 培养 T细胞到达临床数量的时间相对较短 , 且不同病毒载体具有不同表达特点，故在基础研究和
10、临床试验中应用广泛，是目前主要的基因治疗载体。约 70%的治疗方案采用病毒载体。目前最常用的主要是 逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体 等； 非病毒载体有 裸 DNA、脂质体、多聚物分子耦联体 等； 近年来 ,， 微环 DNA被认为是最好的非病毒载体之一 , 在基因治疗中已被广为应用。CAR-T细胞临床应用中的问题CAR-T细胞的脱靶效应 (OFF-TARGET EFFECT)是细胞对设计之外的额外靶点的作用，导致针对正常组织的自身免疫病反应。原因：除了前列腺特异性膜抗原（ PSMA），表皮生长因子受体 （ EGFRv 等肿瘤特异性抗原外，大多数靶点是针对肿瘤相关抗原。这些抗原只是重要组织不表
11、达或是损耗组织表达 。CAR-T细胞的细胞因子风暴 （ CYTOKINE STORM）体液中多种细胞因子如 TNF-、 IL-1、 IL-6、 IL-12、 IFN-、 IFN-、 IFN-、 MCP-1和 IL-8等迅速大量产生的现象，是引起急性呼吸窘迫综合症和多器官衰竭的重要原因。原因： CAR-T细胞更强的亲和力和信号传导功能使其结合相关抗原后，能大量释放细胞因子，引起炎症反应 。CAR-T细胞的插入突变（ INSERTION MUTATION)一个基因的 DNA中如果插入一段外源 DNA片段，那么其结构便被破坏而导致突变，称为插入突变。原因： CAR-T技术是在 T细胞中插入一段外源
12、DNA片段，理论上说其结构已被破坏，存在一定的致瘤风险。CAR-T细胞存在问题的可能解决办法首先 , 很多临床试验采用了剂量爬坡的治疗方法。在同一代次的治疗中 , 把细胞剂量由小到大分散到几次回输中 , 并不断监测细胞毒性 ; 或是应用第一或者第二代 CAR没有观察到毒性后 , 再开始下一代 CAR-T细胞的治疗 , 防止可能 诱发 大 规 模不良反 应 。其次 , 可以引入自杀基因的人工调控开关 , 通过自杀基因系统删除识别靶抗原的剩余 CAR-T细胞 。第三 , 可以把 CAR中信号结构域分裂到两个不同 CAR(信号一 CAR和信号二 CAR), 只有当两个CAR与肿瘤表面的靶抗原都结合以
13、后 , 才能完全激活应答 。第四 , 除了激活受体外 , 还可以引入抑制性 CAR。最后 , 还可以根据靶抗原表达水平 , 微调 CAR亲和性。 小结： 目前来看， CAR-T细胞疗法在血液癌的治疗中已经取得惊人的效果，尤其是针对 B细胞急性淋巴细胞白血病患者的初期缓解率可以达到 90%左右。 但是取得显著疗效的 CAR-T主要还是集中为靶向 CD19的产品， CD19是仅仅表达在 B细胞表面的特异性抗原，利用 CAR-T与 CD19抗原结合，从而消除 B细胞。通常只能在血液恶性肿瘤（白血病、淋巴瘤等）中起到良好的治疗效果。因此， CAR-T研发要取得长远的成功必须解决两个问题：寻找 CD19之外的可以与 CAR-T有高度亲和力的抗原靶标，以及将 CAR-T的适应症从血液肿瘤逐步转向实体瘤这个更大的治疗市场。 研究人员也在积极设计开发新型的 CAR-T疗法，期望在其他血液肿瘤以及实体瘤种发挥类似疗效。寻找 CD19以外的新型的有潜力的抗原靶标，减少毒副反应，克服肿瘤微环境中的免疫抑制作用是目前亟需解决的问题
