1、培养基的制备与灭菌 一、目的要求 1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2. 掌握培养基的配置原则和方法。 3. 掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 2、 基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基： 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌： 主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，
2、获得高于 100的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。 3、 实验材料 1. 药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L 的 NaOH 和 HCl 溶液。 2. 仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三 角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 3. 其他物品：药匙、称量纸、pH 试纸、记号笔、棉花等。4、 操作步骤 （1 ） 玻璃器皿的洗涤和包装 1 玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中
3、烘干后备用。 2灭菌前玻璃器皿的包装 （1 ） 培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包 成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。 （2 ） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作 用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约 0.5cm 左右，棉花自身长度约 11.5cm。塞棉花时可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。 先将报纸裁成宽约 5cm 左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条
4、报纸的一端，约成 45角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。 （2 ） 液体及固体培养基的配制过程 1液体培养基配制 （1）称量（假定配制 1000ml 培养基）按培养基配方比例依次准确地称取 3.0g 牛肉膏、10.0 g 蛋白胨、5.0gNaCl 放入烧杯（或1000ml 刻度搪瓷杯）中牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。 （2 ） 溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约 700ml），用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将药品完全溶解后，补充水到所需的总体
5、积（1000ml ）；如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。 （3）调 pH 调 pH：一般用 pH 试纸测定培养基的 pH。用剪刀剪出一小段 pH 试纸，然后用镊子夹取此段 pH 试纸，在培养基中蘸一下，观看其 pH 范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/L NaoH 或 1mol/L HCl 溶液进行调节。调节 pH 时，应逐滴加入 NaOH 或 HCI 溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用 pH 试纸测试，直至 pH 达7.4-7.6。反之，用 1molLHCl 进行调节。 2固体培养基的配制 配制固体培养基
6、时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.52) 加 入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。 （3 ） 培养基的分装 根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。1试管的分装 取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指
7、夹佐玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为 15150 mm 时，液体培养基可分装至试管高度 14 左有为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高 15(约 34mI)，半固体培养基分装量为管高的 13 为宜。2三角瓶的分装 用于振荡培养微生物时，可在 250 m1三角瓶中加入 50 m1 的液体培养基；若用于制作 平板培养基用时，可在 250 m1 三角瓶中加入 150ml 培养基，然后再加入 3g 琼脂 图 8-2 培养基的分装 粉( 按 2计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被
8、融化。（四）棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎 为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。1试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的 23 在试管内， 13 在试管外。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上
9、。将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。2三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用 8 层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。（五）培养基的灭菌将上述培养基以 0.103MPa，l21，20min 高压蒸气灭菌。灭菌过程：1. 加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇 管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少
10、，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。2. 装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸 汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。3. 加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖， 对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。4. 排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排 气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需 5 分钟。 5.升压：冷空气完全排尽后，关闭排气
11、阀，继续加热，锅内压力开始上升。6. 保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所 需的时间。如本实验中采用 0.1Mpa，121.5，20 分钟灭菌。 灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。7. 降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力 表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼
12、伤操作者。（六）斜面和平板的制作1斜面的制作 将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度 l2 为宜。如制作半团体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至凝固。2平板的制作 将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至 50左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于 50，培养基易于凝固而无法制作平板。 平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入 1015mL 培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。（七）培养基的灭菌检查 灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出 12 管( 瓶)，置于 37温箱中培养12 天，确定无菌后方可使用。
