1、实验四 发酵过程中无机磷的利用一、 目的1、 掌握定磷法的原理和操作技术2、 了解发酵过程中无机磷的利用二、 原理酵母能使蔗糖和葡萄糖发酵产生乙醇和二氧化碳。此发酵作用和糖酵解作用的中间步骤基本相同。在酵母体内蔗糖先经蔗糖酶水解为葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖在发酵过程中再经磷酸化作用和其他反应生成各种磷酸酯。本实验利用无机磷与钼酸形成的磷钼酸络合物能被还原剂 -1，2，4- 氨基萘酚磺酸钠还原成钼蓝的原理来测定发酵前后反应混合物种无机磷（Pi ）的含量，用以观察发酵过程中无机磷的消耗。三、器材试管及试管架、研钵、移液管、小漏斗、滤纸、分光光度计、恒温水浴锅、锥形瓶等四、试剂1、酵母（安琪）2、蔗
2、糖3、磷酸盐缓冲液4、标准磷酸盐溶液5、5%三氯乙酸6、钼酸铵硫酸混合液7、-1，2，4-氨基萘酚磺酸溶液五、 操作1、标准曲线制定：按下表次序在各管内加入不同量的标准磷酸盐溶液和试剂，充分摇匀后于 37水浴中保温10min。冷后，在 660nm 波长下测定吸光值，以含磷量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。应注意：不可待各管都加完 -1，2，4- 氨基萘酚磺酸钠溶液以后再同时混匀。应加一管，混匀一管，力求各管的无机磷与还原剂反应的时间严格一致。管号 标准磷酸盐溶液（ml）含磷量（g）蒸馏水（ml）钼酸铵-硫酸混合液（ml）-1，2，4- 氨基萘酚磺酸钠溶液（ml）660nm吸光值1 0
3、 0 3.0 2.5 0.5 02 0.2 5 2.8 2.5 0.5 0.1003 0.4 10 2.6 2.5 0.5 0.2064 0.6 15 2.4 2.5 0.5 0.3025 0.8 20 2.2 2.5 0.5 0.4026 1.0 25 2.0 2.5 0.537水浴保温10min后冷却至室温0.5012、酵母发酵：称取 2g 酵母和 1g 蔗糖，放入研钵内研碎。加入 5ml 蒸馏水和 5ml 磷酸盐缓冲液研磨均匀。将匀浆转移至 50ml 锥形瓶中并立即取出 0.5ml 均匀的悬浮液，加入到已盛有 3.5ml 三氯乙酸溶液的试管中，摇匀，作为试样 1（应迅速） 。将锥形瓶放入
4、 37恒温水浴中，每隔15min 取出 0.5ml 悬浮液（因有泡沫，最好将锥形瓶倾斜，移液管深入其底部取样） ，立即加入到已盛有 3.5ml 三氯乙酸溶液的试管中，摇匀。共取三次，作为试样 2，3，4。将每个试样静置 10min 后用干滤纸过滤以分别取得各试样的无蛋白滤液。注意在每次吸取悬浮液前，将锥形瓶中的混合物充分摇匀。3、无机磷的测定：取 5 支洁净干燥的试管。编号后按下表加入各种溶液并按标准曲线制定的同样方法操作，以第 5 管作对照（及吸光值调为 0） ，分别测定 660nm 的吸光值，从标准曲线上查出各试样的无机磷含量，以试样 1 的无机磷含量为 100，计算酵母发酵 20、40、60min 后消耗无机磷的相对百分数。管号发酵时间（min）无蛋白滤液（ml）蒸馏水（ml）钼酸铵-硫酸混合液（ml）-1，2，4-氨基萘酚磺酸钠溶液（ml）660nm吸光值含磷量（g）无机磷含量1 0 0.1（试样1）2.9 2.5 0.5 1002 15 0.1（试样2）2.9 2.5 0.53 30 0.1（试样3）2.9 2.5 0.54 45 0.1（试样4）2.9 2.5 0.55 3.0 2.5 0.537水浴保温10min后冷却至室温0 0 0六、 思考题1、什么是糖酵解？指出糖酵解过程中利用无机磷的步骤？
