1、小麦萌发前后淀粉酶活力的比较及电泳法测定蛋白含量一.实验目的1.掌握利用光照培养箱培养小麦的方法；2.了解酶的制备及活力测定的一般原理与方法；3.掌握淀粉酶的活力测定技术，了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化；4.巩固对 721或 722S型分光光度计和离心机的熟练使用；5.灵活运用 3，5-二硝基水杨酸比色法测定样品中还原糖含量的原理和方法；6.掌握 SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳法；二.实验原理种子中的碳水化合物主要是以淀粉的形式存在。淀粉酶是一种水解酶，它能使淀粉水解为麦芽糖，催化反应为：2（C 6H10O5）+n H 2O-n C12H22O11麦芽糖具有还原性，与 3，5-二硝基水杨酸在
2、供热的条件下生成棕色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，棕色物质颜色的深浅程度与还原糖的量成正比，因此可利用比色法测定还原糖的量。休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌发后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。三.实验步骤1.种子发芽小麦种子浸泡 2.5h后，放入 25恒温箱内发芽。2.酶液提取取发芽第三天或者第四天的幼苗 8株，放入研钵中，加入石英砂少许，加入 PH6.8磷酸盐缓冲液 10ml，研磨至匀浆状。在室温下静置 20min，搅拌几次。提取液 1500rpm离心7min。上清倒入量筒，测定酶提取液总体积，并将酶液稀释 10倍。取干燥种子或者浸泡 2.5h后的种子 8粒作
3、为对照，步骤同上。3.SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳法测定蛋白条带。4.酶活力的测定（1）取大试管 6支，按照下表加入各试剂（1）取大试管 6支，按照下表加入各试剂空 白 标 准 萌 发 前 萌 发 后123456酶 液 （ ml） 0.50.50.0.50.1%麦 芽 糖 （ ） 0.5淀 粉 （ ） 111111水 （ ml） 0.5将各试管摇匀，放入 37水浴锅中保温 3min，立即向各试管中加入 DNS试剂 2ml。（2）取出各管，放入沸水浴中加热 5min，流水冷却至室温，加水稀释至 25mL，充分混匀后 1:1稀释。用空白管做对照，在 520nm处测定各管 OD值，并对 3和 4、
4、5 和 6管分别取平均值作为萌发前和萌发后的 OD值。四.计算根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即A 标准 /A 未知 =C 标准 /C 未知 可推导出 C 酶液 =A 酶液 /A 标准 C 标准8粒的总活力=C 酶 n 酶 V 酶A为光吸收值；C 酶 =酶液管的麦芽糖浓度;n 酶 =酶液稀释倍数;V 酶 =提取酶液总体积。五蛋白质浓度测定-考马斯亮蓝 G250染色法蛋白质定量测定溶液 0管 酶液（萌发前） 酶液（萌发后）蛋白液/mL - 0.1 0.10.9%生理盐水/mL 1.0 0.9 0.9蛋白质染色液/mL 5.0 5.0 5.0轻轻摇匀，5min 后以 0管调空白，595nm
5、分光光度法测光密度值。六、实验结果（1）酶活力的测定萌发前 萌发后酶提取液总体积 9ml 8ml酶液最终稀释后测定的小麦萌发前与萌发后的 OD值空白 标准 萌发前 萌发后1 2 3 4 5 6OD值 0.248 0.217 0.185 0.612 0.669平均值 0.248 0.201 0.641n 酶 =10（25/0.5 ）2=1000 ， A 标准 =0.248，C 标准 =0.001%，1、 萌发前：A 酶液 =0.201， V 酶 =9.0mlC 酶液 =A 酶液 /A 标准 C 标准 =0.201/0.2480.001%8粒的总活力=C 酶 n 酶 V 酶 =0.07292、萌发
6、后：A 酶液 =0.641， V 酶 ,=8.0ml，C 酶液 =A 酶液 /A 标准 C 标准 =0.641/0.2480.001%8粒的总活力=C 酶 n 酶 V 酶 =0.207（2）蛋白质浓度的测定萌发前 萌发后1 2 3 4OD值 0.104 0.121 0.064 0.128平均值 0.113 0.096小麦萌发前：A 蛋白质 =0.113由标准曲线，Y=0.0081X 0.0515，R2=0.9842 可知，x 为 20.3086，由于酶液被稀释了 10倍，所以，蛋白质浓度为 203.086g/ ml。小麦萌发后：A 蛋白质 =0.096由标准曲线，Y=0.0081X 0.0515，R2=0.9842 可知，x 为 18.2099，由于酶液被稀释了 10倍，所以，蛋白质浓度为 182.099g/ ml。七、讨论由实验数据结果可以看出小麦萌芽后淀粉酶的活力会比萌芽前明显增强，小麦种子在萌发过程中淀粉酶活力升高，淀粉被大量水解为小分子糖，那么就可以提供较多的能量供应萌发时候的细胞分裂以及细胞生长使用，同时还能够为细胞的生命活动提供原料，能够更快地将储存的有机物中的能量释放出来，保证萌发过程能量供应充足。八、实验注意事项1、种子研磨应均匀，以助于酶液的提取。2、在测定蛋白质浓度及酶液时，应快速测量，以防止反应试剂的分解，提高测定的正确性。3、实验过程中注意安全。
