1、牛奶中酪蛋白的提取及含量测定一、实验原理1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%） 、脂类（4%） 、蛋白质（3.5%） 、维生素、微量元素（Ca 、P 等矿物质） 、水（87%）牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖，它由 D-半乳糖分子和 D-葡萄糖分子通过 -1,4- 糖苷键连接而成。乳糖溶于水，不溶于乙醇，当乙醇混入乳糖水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白两种，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的 80%。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。而乳清蛋白水合能力强，分散性强，在牛乳中呈高分子状态。2、等电点沉淀法：在等电点时，
2、蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等电点为 4.7 左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同） ，本实验中将牛乳的 pH 调值 4.7 时，酪蛋白就沉淀出来。市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂来增加粘稠度，以致即使 pH 调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将 pH 稍微调过多一点再调回等电点。同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使 pI 偏离了4.7，通常偏酸。3、酪蛋白的提
3、纯根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙醚洗涤，由于乙醚很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法）考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝 G520 的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在 465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为 595nm。在一定范围内，考马斯亮蓝G520-蛋白质复合物呈色后，在 595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。二、实验器材与试剂1、器材：恒温水浴锅、离心机、抽滤装置、蒸发
4、皿、精密 pH 试纸、旋涡混合器、紫外分光光度计、试管*9、5mL 吸管、50mL 容量瓶、100mL 量筒、电子分析天平2、试剂：鲜牛奶、pH4.7 醋酸-醋酸钠缓冲溶液、乙醇 -乙醚混合液（95%乙醇、无水乙醚体积比 1：1） 、0.9%NaCl 溶液、标准蛋白液（0.1mg/mL 牛血清蛋白） 、考马斯亮蓝 G520 染液三、实验操作记录1、酪蛋白的制备将 20mL 牛奶盛于 100mL 的烧杯中加热到 40，在搅拌下慢慢加入预热至40、 pH4.7 的醋酸缓冲溶液 20mL。用冰醋酸调节溶液 pH 至 4.7，此时即有大量的酪蛋白沉淀析出。将上述悬浮液冷却至室温，离心 5min（400
5、0r/min） ，弃去上清液，沉淀即为酪蛋白粗品。用蒸馏水洗涤沉淀 3 次（每次约 20mL） ，离心 5min（3000r/min ） ，弃去上清液。在沉淀中加入约 20mL95%乙醇，搅拌片刻，将全部的悬浊液转移到布氏漏斗中抽滤，用乙醇-乙醚混合溶液洗涤沉淀 2 次，最后用乙醚洗涤沉淀 2 次，抽干。将沉淀摊开在培养皿中，风干，保存至下周。2、标准曲线的制作取 7 支干净干燥试管，按下表进行编号并加入试剂。混匀，室温静置 3min，以第一管为空白，于波长 595nm 处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度为横坐标得标准曲线。表 1 标准曲线的制作试剂编号 1（空白）2 3 4
6、5 6 7标准蛋白液/mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.80.9%NaCl/mL 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2考马斯亮蓝染液/mL4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0蛋白质浓度/(g/mL)0 10 20 30 40 60 805950.000 0.151 0.260 0.326 0.440 0.535 0.6363、样液的测定准确称取 25mg 自制酪蛋白，置于 50mL 烧杯中，加入约 20mL0.9%NaCl，再准确加入 1mol/L NaOH 5mL，当酪蛋白溶解后，准确加入 1mol/L 乙酸 5mL，充分振摇直至酪蛋白完全
7、溶解为止（不溶可在 50水浴加热至溶） ，全部转移至 50mL 容量瓶中，加 0.9%NaCl 稀释定容至 50mL，充分摇匀。取 5mL 上述蛋白液，转移至另一个 50mL 容量瓶中，用 0.9%NaCl 稀释定容至 50mL。另取一支干净试管，加入样品液 1.0mL 及考马斯亮蓝染液 4.0mL，混匀，室温静置 3min，于波长 595nm 处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。四、实验结果1、酪蛋白产量及产率计算表 2 酪蛋白产量及产率计算酪蛋白质量/g 牛奶样品质量/g 产率/g0.78 20.03 3.89%2、标准曲线0 10 20 30 40 50 60 7
8、0 80 9000.10.20.30.40.50.60.70.80.9标 准 曲 线蛋 白 质 浓 度 （g/mL ）A595nm由散点图可以看出，后两个点与前面几个点的线性关系并不好，出现了明显的负偏差。故在线性拟合时舍去后两个点，取前 5 个点进行拟合。拟合出的直线 R达到 0.983，线性较好。2、 样品液的吸光度是 0.324，对照标准曲线得酪蛋白浓度为 28.40g/mL。称取的酪蛋白样品质量为 0.0267g，稀释倍数为 500 倍。= =53.2%（ 酪蛋白 ） =酪蛋白浓度 1.0500样品质量 100%28.4010615000.0267100%五、误差分析与讨论1、本次制备
9、实验中得到的蛋白质量较多，但纯度较低，分析原因如下：1）得到的蛋白质略呈黄色，且有些发粘，说明可能脱脂不彻底，蛋白质产品中含有脂质。2）考马斯亮蓝 G520 染液中有沉淀，最后影响考马斯亮蓝- 蛋白质复合物溶液的吸光度。3）配制标准溶液时操作上可能有误差，如往试管中加入溶液时挂在管壁，且最终也没有与下方溶液混合均匀，导致标准溶液的浓度可能不准，致使标准曲线不准，数据处理时也发现数据线性并不好，尤其是浓度较大时，虽然可能是超出考马斯蓝线性范围，但不能排除操作失误的可能。2、注意事项1）试管提前一周清洗干净并晾干，否则制作标准曲线时无法保证各管浓度。并且不干净的试管在加溶液时容易挂管壁，不利于控制标准蛋白液浓度。2）在配制不同浓度标准蛋白液时，各组分的体积要准确移取，特别是量较少的标准蛋白液，只要稍微洒出一点就会导致较大的相对误差3）蛋白质粗品的洗涤一定要按照规范做，每一次离心洗涤时要将搅匀，在布氏漏斗上洗涤时要先微接抽气管，待洗出液缓慢流出后，再接紧橡皮管抽干。
