1、细菌LD50测定方法,报告人：张玉晴 指导老师：李槿年教授,大纲,半数致死量：LD50（Lethal dose）表示在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的某种动物半数死亡所需最小细菌数或毒素量。,1、寇氏法/改良寇氏法 2、累计法（Reed-Muench法） 3、霍恩氏法（Horn氏法） 4、加权法 5、序贯法 6、固定剂量法 7、logistic模型法,1、寇氏法/改良寇氏法公式：LD50= lg -1Xm i (P 0.5)X50=lgLD50LD50 95%可信限=lg -1（X50 1.96SX50）LD50平均可信限=LD50 （LD50可信限高限-低限）/2,Xm：最大
2、剂量的对数值i ：相邻两组剂量对数值之差P：各组动物死亡率，用小数表示P：各组动物死亡率之总和n：每组动物数,预试验找出引起0%死亡率和100死亡率剂量的所在范围 反应量大致呈正态分布 剂量必须按等比级数分布 各组动物数相等,2、累计法（Reed-Muench法）它是先将实验死亡动物数和存活动物数进行累计加和, 再用加和的数据计算死亡率。在死亡率中有2个数据A和B,且A刚好大于50%,B刚好小于50%,计算方便, 更多地运用在微生物学中, 尤其在稀释分析中 不考虑操作误差, 计算结果不够精确, 粗略判断LD50。,35%来苏尔浸泡24h 自来水冲洗,1,5,4,3,2,一、实验准备：,二、细菌
3、总数测定,挑取HX4 单个菌落,10mL生理 盐水重悬,100mLBHI 液体培养基,离心收 集菌体,洗涤菌 体3次,测量菌落大小,30 150r/min 振荡培养24h,8000r/min 离心8min,平板菌落计数法计数,4保存用于攻毒,10-1,10-3,10-2,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9,30倒置培养24h,记录平板上菌落数量，肉眼观察+放大镜检查,数据处理选取同一稀释度平均菌落数在30300个之间的平板 1、一个稀释度，平均菌落数在30300个之间时，乘以稀释倍数报告。 2、如有两个稀释度平均菌落数均在30300个之间，则应求出两者总菌数之比，比值小
4、于或等于2应报告平均数，大于2则报告其中较小的数字。 3、如所有稀释度的平均菌落数均多于300个，应按稀释度最高的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。4、如所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则按稀释倍数最低的平均菌落数，乘以稀释倍数报告。 5、如所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一个稀释度大于300，而相邻的另一稀释度小于30，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告。,三、攻毒,0.01g/L MS-222 麻醉,0.3mL,1.21010,2.4109,4.8108,9.6107,1.9107,分别腹腔 注射5组鱼,三、攻毒观察7天内草鱼的发病和死亡情况，记录结果，按Re
5、ed-Muench氏法计算LD50病死鱼无菌解剖，观察内脏病变情况，并用接种环蘸取内脏接种于BHI固体培养基上，30培养2d，对分离到的细菌进行革兰氏染色镜检。,0,表1 HX4菌对斑马鱼的毒力（LD50）,1,3,6,11,14,9,5,2,0,数据汇总： 组别 稀释比例 死亡率 1 原液 100% 2 1:3 90.0% 3 1:9 62.5% 4 1:27 22.2% 5 1:81 0.0%,7、LD50计算距离比例r=（高于50%死亡率50）（高于50%死亡率低于50%死亡率）=（62.550）（62.522.2）=0.310lgLD50=高于50%死亡率稀释度倒数的对数+距离比例稀释倍数的对数=lg9+0.310lg3=1.1021 LD50=14.3515 即当细菌原液稀释成1:14.3515时，腹腔注射斑马鱼，能使50%斑马鱼发生死亡。,综上所述：拟态弧菌HX4对斑马鱼 半数致死量=1/14.35151.210100.05=4.2107,1、稀释度确定：3倍比？ 5倍比？or 10倍比？2、注射方法：防止溢出,谢谢大家提出宝贵意见,
