1、PCR 反应体系中各种成分的作用 不同模板浓度的实验结果 用相同的引物、两种不同的模板 ,对 6 种不同模板量进行扩增 ,发现在模板量 200时 ,会出现大片段扩增产物的缺失或无扩增产物 ,且点样孔至泳道会出现相应增强的弥散背景。综合考虑 ,在 25 的反应体系中 ,模板以 25 100 为最适用量。同时模板在 200以下不影响扩增结果 ,但为降低缓冲液中对反应体系中 2+的不良影响程度 ,应该尽量降低模板用量。 不同 2+浓度时实验结果 设置不同 2+浓度 ,当 2+浓度为 1 0时 ,无扩增产物 ; 2+浓度为 1 5 2 5时 ,随着 2+浓度的增加 ,扩增产物带型基本一致 ,但以 2
2、0 的扩增效果最好 不同引物浓度对结果的影响 设置 5 种不同浓度的引物进行扩增 ,当引物浓度在 0 1 0 2 时 ,扩增结果基本一 致 ;但随着引物浓度的逐渐增加 ,开始出现弥散背景增强的趋势 ,并且有些扩增带发生减弱或缺失。为了保证反应结果的稳定性和特异性 ,引物浓度以 0 .2 左右为宜 。 不同浓度对结果的影响 采用 2 种引物 ( 17、 16),分别以 4 种不同的浓度进行反应 ,发现浓度在 100 、 150 、 200 、 300 时 ,随着浓度的减小 ,扩增带明显减少或扩增强度减弱 ,当浓度 38 时 ,最适延伸温度会超过 Taq DNA 聚合酶的最适温度 74 ,不能保
3、证引物的特异性。 (2)引物中碱基的分布应当是随机的 ,避免一连串相同的碱基。3，端不应超过 3 个连续的 G 或 C,因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。 (3)G+C 含量在 40 60。 (4)两个引物在 3，端绝对不能出现同源性 ,否则会形成二聚体。两引物之间不应有互补性 ,引物间连续的互补碱基必须少于 4 个。 2.引物的 3，端 引物的延伸是从 3，端开始的 ,因此 ,引物 3，端的末位碱基在很大程度上影响 Taq DNA 聚合酶的延伸效率 ,不能进行任何修饰。 实验表明 ,不同碱基的引发效率在引物 3，端末位碱基处有错配时 ,有很大的不同。同等条件下 ,引物 3，端第
4、2 位或 3、 4 位的错配对扩增量影响不大 ,但易出现非特异扩增和引物二聚体。所以在设计引物时 ,应注意引物 3，端尽量不用 T,尤其应避免连续 2 个或 2 个以上的 T。 3.引物的 5，端 引物的 5，端对扩增特异性影响不大。因此可以被修饰而不影响扩增的特异性。如增加酶切位点、引入突变位点、标记生物素等。 4.密码子的简并 ,如扩增 3，端区域 ,引物 3，端不要终止于密码子的第 3 位 ,因密 码子的第 3 位易发生简并 ,影响扩增特异性与效率。 (二 )引物的浓度 为使 PCR 效率达到最高，必须保证反应混合物中有足够的引物和 dNTP。一般 PCR 反应中 ,引物的终浓度为 0.
5、2 1 mol/L。在此范围内， PCR 产物的量基本相同；但引物低于 0.2 mol/L 时，产物量降低。引物浓度过高则会促进非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体又可作为 PCR 反应的底物 ,与靶序列竞争 DNA 聚合酶和 dNTP 底物 ,从而使靶序列的扩增量降低。 几乎所有形式的 DNA 和 RNA 都是 PCR 反应的合适底 物，包括基因组 DNA、质粒 DNA、噬菌体 DNA、预先扩增的 DNA、 cDNA 和 mRNA。大多数 PCR 操作中 ,对 DNA 模板的要求都不高 ,纯度要求亦不严 ,用量很低。理论上 ,单拷贝基因都可以扩增 ,但从高度复杂的
6、 DNA 样品中进行扩增 ,可能比从质粒、噬菌体中进行扩增要困难些，如在 PCR 反应前用机械剪切或稀有限制酶消化基因组 DNA 可提高产量。 核酸标本来源广泛 ,可以从纯培养的细胞或微生物中提取 ,也可以从临床标本 (血、尿、粪便、体腔积液、嗽口水等 )及其他标本 (血斑、毛发、 精斑等 )中直接提取。无论标本来源如何 , 待扩增核酸都需部分纯化以去除核酸标本中的 DNA 聚合酶抑制物。以 RNA 作为模板进行扩增时 ,需要逆转录成 cDNA 后才能进行正常的 PCR 循环。 PCR反应中的模板加入量一般为 102 105 个拷贝靶序列。人基因组 DNA 1 g 相当于 3 105 个单拷贝
7、靶分子 ;大肠杆菌 DNA 1 g 相当于 3105 个靶分子。对于细菌基因组 DNA 或质粒 DNA，每次反应所需量仅为 pg 到 ng 级。 扩增靶序列的长度根据不同的要求而不同，目的物一般在500bp 以内 ,以 100 300bp 为佳。对扩增较长的 PCR 片段 ,模板的质量最为重 要 ,在抽提纯化 DNA 的过程中 , 应最大限度地避免其损伤。操作时尽可能减少反复吹打 ,可选用大孔径吸头 ,以避免对 DNA 的随机剪切。 PCR 缓冲液（ PCr Buffer） 用于 PCR 的标准缓冲液见 PCR 操作范例。于 72时，反应体系的pH 值将下降 1 个单位，接近于 7.2。二价阳
8、离子的存在至关重要，影响 PCR的特异性和产量。实验表明， Mg2+优于 Mn2+，而 Ca2+无任何作用。 1 Mg2+浓度 Mg2+的最佳浓度为 1.5mmol/L(当各种 dNTP 浓度为 200mmol/L 时 )，但并非对任何一种模板与引物的结合 都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把 Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为 1 10mmol/L。 Mg2+过量易生成非特异性扩增产物， Mg2+不足易使产量降低。 样品中存在的较高浓度的螯合剂如 EDTA 或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与 Mg2+结合而降低 Mg2+有效浓度。因此，用作模板的 DNA 应溶于 10mm
9、ol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。 dNTP 含有磷酸根，其浓度变化将影响 Mg2+的有效浓度。标准反应体系中 4 dTNPs 的总浓度为 0.8mmol/L，低于 1.5mmol/L 的 Mg2+浓度。因此，在高浓度 DNA 及 dNTP 条件时，必须相应调整 Mg2+的浓度。 2 Tris -HCl 缓冲液在 PCR 中使用 10 50mmol/L 的 Tris HCl 缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。 Tris 缓冲液是一种双极化的离子缓冲液， pKa 为 8.3(20 ), pKa 为 0.021/。因此， 20mmol/l Tris pH8.3
10、(20 )时，在典型的热循环条件下，真正的 pH 值在 7.86.8 之间。 3 KCl 浓度 K+浓度在 50mmol/L 时能促进引物退火。 但现在的研究表明， NaCl 浓度在 50mmol/L 时， KCl 浓度高于 50mmol/L 将会抑制 Taq 酶的活性，少加或不加 KCl 对 PCR 结果没有太大影响。 4明胶明胶和 BSA 或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为 100 g/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR 结果，影响不大。 5二甲基亚砜（ DMSO） 在使用 Klenow 片段进行 PCR 时DMSO是有用的；加入 10%DM SO有利于减少 D
11、NA的二级结构，使（ G+C） %含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入 DMSO 使 PCR 产物直接测序更易进行，但超过 10%时会抑制 Taq DNA 聚合酶的活性，因此，大多数并不使用 DMSO。 模板 单、双链 DNA 或 RNA 都可以作为 PCR 的样品。若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条 cDNA。虽然 PCR 可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的 DNA，但为了保证反应的特异性，还应用 ng 级的克隆 DNA， g 水平的单拷贝染色体 DNA 或 104 拷贝的待扩增片段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、 Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白。 DNA 的大小并不是关键的因素，但当使用极高分子量的 DNA（如基因组的 DNA 时），如用超声处理或用切点罕见的限制酶（如 Sal1和 Not1）先行消化，则扩增效果更好。闭环靶序列 DNA 的扩增效率略低于线状 DNA，因此，用质粒作反应模板时最好先将其线状化。 模板靶序列的浓度因情况而异，往往非实验人员所控制，实验可按已知靶序列量逆减的方式（ 1ng,0.1ng,0.001ng 等） ，设置一组对照反应，以检测扩增反应的灵敏度是否符合要求。
