1、 生化作业 2013.11.22第 1 页 共 3 页问题:作为无经验的新手学生，在生化实验室中，前几周时间花在洗玻璃器皿和黏贴试管标签上。后来过渡到配制各种实验步骤的缓冲液和母液。最后，叫你负责一个蛋白质的纯化，这是柠檬酸循环中的一个酶，位于 Mi 基质中的柠檬酸合酶(存在于真核细胞的线粒体中)。按照一个纯化程序，你根据下列步骤进行。在你工作的时候，一个更有经验的学生问你每一步步骤的基本原理，请提供答案（1）你从附近的屠宰场买到 20kg 的牛心脏，在冰上带回，在冰上进行每一个步骤。你用高速匀浆器在含 0.2M 蔗糖，pH7.2 的缓冲液中使牛心组织匀浆问：你为什么使用牛心组织，且用那么大的
2、量？目标蛋白质(柠檬酸合酶)存在于真核细胞的线粒体中,牛心组织中线粒体含量较高;使用的量大是为了最后获得较多的蛋白质(柠檬酸合酶).将组织保持低温状态和悬浮在 0.2M 的蔗糖， pH7.2 的缓冲液中的目的是什么？蔗糖可以形成密度梯度,蔗糖形成的密度梯度的最大值比叶绿体匀浆介质密度要小，满足之后差速离心对密度梯度的要求;低温可以起到保护作用，防止蛋白变性,保持酶活性.当组织匀浆后发生了什么变化？蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持原来的天然状态,不失去生物活性.（2）你把得到的牛心匀浆用一系列的差速离心，这是什么目的？将目标蛋白质(柠檬酸合酶柠檬酸合酶)和组织中的其他物质、
3、蔗糖等分离出来.（3）你继续用含大多为完整 Mi 的上清液纯化。接着，你用渗透法裂解 Mi，裂解液主要为 Mi 膜和线粒体内容物组成，对此裂解液，你加入中性盐至特定浓度，然后离心，收集上清液，在上清液中继续加入中性盐，然后离心，保留沉淀，沉淀中含有要分离的蛋白质问：两步加中性盐的原理是什么？第一步:低盐浓度下,增加蛋白质分子间静电斥力,使蛋白质溶解度增大,即发生盐溶现象.生化作业 2013.11.22第 2 页 共 3 页第二步:中性盐使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀,是蛋白质溶解度下降,即发生盐析现象.（4）你把沉淀物重新溶解，用大体积的 pH7.2 的缓冲液透析过夜。问：为什么此步骤中透析缓冲
4、液中不加中性盐?防止蛋白质发生盐析形成沉淀为什么使用缓冲液而不是水？纯水透析时会使透析袋中的离子强度降低,可能导致蛋白质变性从而引起蛋白凝集出现沉淀.（5）你将透析后的溶液进行凝胶过滤层析，根据方法，你收集从柱子上下来的第一个组分，弃去其它的组分。你检测各组分蛋白质是通过紫外吸收法。问：你收集第一个组分这一操作告诉你关于这个蛋白质的什么信息该蛋白质比凝胶孔径大,最先被洗脱出来.为什么 OD280 是检测洗脱组分中蛋白质的存在的方法紫外吸收法是根据物质对不同波长的紫外线吸收程度不同而对物质组成进行分析的方法,目标蛋白质所含氨基酸具有吸收紫外光的性质.（6）你把上一步中收集到的组分进行阳离子交换。
5、当除去开始流出柱子的溶液后，你在柱中加入较高 pH 值的洗脱液，然后收集流出液，解释你在干什么目标蛋白质溶液通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争结合;在柱中加入较高 pH 值的洗脱液，降低了蛋白质和离子交换剂之间的亲和能力,使得蛋白质被从树脂柱上洗脱下来.（7）你将所得样品进行等电点聚焦电泳，染色后，胶上表现出三条清晰的带。根据经验，感兴趣的蛋白质的 PI 为 5.6，但你决定再测一下蛋白质的纯度，你把 PI5.6 的带切下，进行 SDS-PAGE，此蛋白质表现出单一带。问：为什么你不能确定等电点聚焦后的单条带是纯品？处在等电点聚焦后的同一条带上的蛋白质等电点相似,但不一定是纯种蛋白质.SDS 的结果告诉你什么？pI 为 5.6 的蛋白质是纯品.生化作业 2013.11.22第 3 页 共 3 页为什么在等电聚焦后还要跑 SDS-PAGE双向电泳中,电聚焦电泳是按照 pI 分离，SDS-PAGE 是按照分子大小;等电点聚焦不能确定一定是纯品,而跑 SDS-PAGE 之后则可以确定是纯品.
