1、第一节 体细胞胚的概念及其发生途径 第二节 人工种子,体细胞胚及人工种子,第一节 体细胞胚的概念及其发生途径,体细胞胚（somatic embryo）又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。,胚的发育图,一、体细胞胚的概念,(A) 伸长期合子；(B) 合子经过第一次分裂, 产生1 个顶细胞(绿色)和一个基细胞(粉红色)；(C) 四分体胚: 顶细胞经历2 次纵向分裂，产生含有4 个细胞的胚体和2 个细胞的胚柄；(D) 16 细胞球形胚: 8 细胞胚的所有细胞经过1 次平周分裂, 产生包含8 个细胞的表皮原和8 个细胞的内部组织；(E) 早期心形胚；(F) 心形胚: 子叶
2、和胚根原基已经出现；(G) 成熟胚胎。 1: 顶细胞; 2 : 基细胞; 3: 胚根原细胞, 形成未来的ROC 和根冠中央区; RM: 根尖生长点; SM: 茎尖生长点,双子叶植物的胚胎发育过程,*大量研究表明，大多数植物组织培养，单细胞悬浮培养、原生质体培养和花粉培养中都观察到体细胞胚胎发生或花粉胚胎发生（pollen embryogenesis） *前者为二倍体的体细胞产生的胚状结构 *后者是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的体细胞胚，通常称花粉胚（pollen embryos），可发育成单倍体植株。,体细胞胚的产生,植物体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有明显的特点： 1、具有两极性
3、 2、存在生理隔离 3、遗传性相对稳定,二、体细胞胚胎发生的方式 *植物组织培养过程中植物体细胞胚胎途径可归纳为两类：直接途径和间接途径。 *直接途径是直接从原外植体不经愈伤组织阶段发育而成 *间接方式是体胚从愈伤组织或悬浮细胞、有时也从已形成的体胚的一组细胞中发育而成，如香雪兰（Freesia refracta）花序外植体经直接体细胞胚胎发生途径形成再生植株。,1 直接途径 直接发生体胚的来源细胞可以是外植体表皮、亚表皮、幼胚、悬浮培养的细胞和原生质体。 一般认为直接方式发生体胚是由原先就存在于外植体中的胚性细胞预胚胎决定细胞（PEDCs）培养后直接进入胚胎发生而形成体胚，如柑桔属的珠心组织
4、（在体内或离体情况）通过预胚胎决定细胞直接进行体胚发生的最好例子.,2 间接途径 间接体细胞胚胎发生中，外植体已分化的细胞先脱分化，并对其发育命运重决定而诱导出胚性细胞诱导胚胎决定细胞（IEDCs），进而形成体细胞胚。,1 茎尖培养诱导形成胚性愈伤组织 MS培养基附加2.0mg/L 2,4-D,2 胚性愈伤组织悬浮培养增殖 MS培养基附加2.0mg/L 2,4-D,3 由细胞集合体形成体细胞胚 MS培养基附加2.0mg/L 2,4-D,4 体细胞胚萌发并形成小植株 MS培养基附加1.0mg/L ABA,图 甘薯品种栗子香胚性愈伤组织诱导体细胞胚和再生小植株,三、体细胞胚的起源,*体细胞胚胎发生
5、途径有直接途径和间接途径，但无论哪一种发生途径，绝大多数研究报道认为体细胞胚胎起源于单细胞,从多种植物中都观察到单个胚性细胞，有不均等分裂的二细胞原胚和均等分裂的二细胞原胚、多细胞原胚、球形胚直到成熟胚。也有研究认为起源于多细胞。,*在同一块愈伤组织或一个胚性细胞复合体上可以观察到多个不同发育时期的体细胞胚，从单个原始细胞到多细胞的原胚、球形胚、鱼雷胚直至具子叶的胚状体，这是由体细胞胚发生和分裂的不同步所致。,香蕉心形体细胞胚,可可心形胚A和球形胚B,A,B,1 体细胞胚的单细胞起源,野胡萝卜的胚状体 A. 心形期胚状体 B. 成熟胚状体 C. 早心形期胚状体 D. 两个成熟胚状体共一个胚柄,
6、*有的学者观察到体细胞胚来源于多细胞组成的胚性细胞复合体，王亚馥等人也观察到这种胚性细胞团，但用同位素脉冲标记实验即可证明这些细胞团也是由一个单细胞连续分裂而形成，经进一步分化和分裂形成不同发育时期的体细胞胚，因而这些体细胞胚实质也可能是起源于单细胞。当然也不排除有些植物的体细胞胚的确是起源于多细胞，仍有待深入研究。,*总之，体细胞胚胎的发生是一个非常复杂的生理过程，仍有许多问题尚需进一步研究。,2 体细胞胚的多细胞起源,四、体细胞转变为胚性细胞的机制,*合子胚来源于受精卵；体细胞胚是非合子胚，未经过雌雄配子受精这一过程，机制是什么？,*体细胞胚无论起源于哪一种细胞，都存在着一个共同的问题，即
7、体细胞是如何转变为胚性细胞而形成体细胞胚的。大量研究事实表明，植物细胞在一定培养条件下，具胚胎发生能力可能是一个普遍现象。,1 体细胞胚发生理论渐变理论 （1）体细胞胚胎发生实质 *体细胞胚胎发生实质是细胞分化的问题，而细胞分化的分子基础则是基因差别表达与调控的结果。有关细胞分化的分子机制有许多理论，其中最具普遍性的是渐变理论，认为一个细胞系的细胞质因子间的互相作用是一个原发稳定基因组中基因活化的结果，从而使该细胞系与其它细胞系不同。,外植体,脱分化,愈伤组织,细胞分化,胚性细胞,非胚性细胞,基因调控,（2）渐变理论认为细胞分化可分为几个阶段？ 分为两个阶段： 第一阶段为预定阶段，细胞接受了或
8、预定了特殊发育命运，但并未表现出可见的特化标志，这种特性一旦建立就可以在细胞继代培养中得以稳定保持。 第二阶段是表达阶段，在适宜条件诱导下，预定的细胞（pro-embroygenic determined cells, PEDC）发生一系列生理生化和形态上的变化，表现出分化的特性，但由于这种表达与培养过程中诱导因素关系密切，而表现为一种生理反应，是不稳定的。,（3）渐变理论的不足 （一）未揭示体细胞胚胎发生的实质，以及细胞的预定性是如何实现的问题。 （二）不能解释经多次继代培养的细胞往往会失去胚胎发生能力，因其理论认为预定性细胞在以后的培养过程中处于稳定状态。 （三）不能解释体细胞胚胎直接发生
9、途径和间接发生途径可因条件不同而相互转化的问题。,*按预决定观点，从外植体组织或细胞直接形成体细胞胚的途径，需要一种诱导物的合成或抑制物的消除，来恢复有丝分裂活动和促进胚胎发育。这时生长素对胚胎发生常起抑制作用，去掉生长素并给以必要的条件就使细胞进入分裂周期，并进行胚胎发生的表达。 *从外植体经过脱分化形成愈伤组织，间接产生体细胞胚的途径，则需要分化细胞的重新预决定，称为诱导的胚胎预决定的细胞（induced embroygenically determined cells,IEDC），这时则需要生长素，诱导细胞进入细胞周期。生长素不仅作为使细胞发生分裂所必需的物质，而且也是使细胞进入胚胎状态
10、所必需的因素。,（4）按预决定观点，生长素对由直接途径和间接途径体细胞胚发生的作用,五、体细胞胚发育成植株的能力,1 体细胞胚发育成植株的能力 *一般来说胚胎一旦被分化出来或甚至完成诱导之后转移到基本培养基上即可发育成熟，并可形成小植株。 *如陈东方等（1986）对棒头草幼穗培养的研究表明，体细胞胚形成之后，可以在原来培养基上或MS无任何附加成分的培养基上以及1/2MS加IAA或NAA 0.5mg/L和6-BA 0.5mg/L培养基上萌发形成小植株。,1 茎尖培养诱导形成胚性愈伤组织 MS培养基附加2.0mg/L 2,4-D,2 胚性愈伤组织悬浮培养增殖 MS培养基附加2.0mg/L 2,4-
11、D,3 由细胞集合体形成体细胞胚 MS培养基附加2.0mg/L 2,4-D,4 体细胞胚萌发并形成小植株 MS培养基附加1.0mg/L ABA,图 甘薯品种栗子香胚性愈伤组织诱导体细胞胚和再生小植株,2 体细胞胚萌发的两种不正常现象 体细胞胚萌发时观察到两种不正常萌发现象： *一种是不完全萌发，即只有芽而无根或只有根而无芽. *另一种是早熟萌发，即体胚还未表现出完整的胚结构之前就已萌发，萌发时盾片膨大形成一叶状体，在叶状体基部长出芽。,注意：体细胞胚胎途径的形态发生能力要比器官分化途径保持更长久。,六、影响体细胞胚发生的因素,1、基因型与体细胞胚发生 基因型是影响体细胞胚发生的重要因素，体细胞
12、胚的诱导率和每个胚性外植体上体细胞胚的发生率因基因型而异。,（a）不同基因型体细胞胚诱导率； （b）不同基因型每个胚性外植体上体细胞胚的数目 图6.7 在相同培养基上Feijoa sellowiana Berg不同基因型体细胞胚诱导 （引自Miguel等，2001）,2、植物激素与体细胞胚发生 *离体植物细胞在开始往往缺乏合成生长素和细胞分裂素的能力，但是在大多数情况下，这些细胞的分裂和分化以及形态建成过程中又必需生长素和细胞分裂素两种激素的共同作用。 *在培养介质中添加不同种类或不同浓度的外源激素诱导形态发生已受到广泛的重视。 *但最关键的是组织内部和体细胞胚发生部位的内源激素代谢动态和平衡
13、。,定义：胚培养是指使对植物的胚、子房、胚珠（具胚器官）及胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。 范围：根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。,胚培养,胚胎培养的意义和类型,A 克服远缘杂交的不育性，获稀有杂种植物 B 打破种子休眠，缩短育种年限。,许多落叶果树，特别是杂交种产生早熟、生活力低下甚至无活力的种子，利用胚胎培养可使种子萌发，提高萌发率。,C、使生活力低下或无生活力的种子萌发,这类植物种子内存在大量的珠心胚，珠心胚生活力很强，因而往往得不到合子胚后代，影响杂交育种结果，利用胚培养可以尽早取出合子胚进行培养，从而获得杂种后代。
14、,D、使柑橘类植物合子胚正常发育,因被子植物胚乳细胞大多为三倍体，胚乳培养可以获得三倍体植株，从而使植物胚胎培养成为一种新的育种途径，用于果树、瓜类等经济作物产生无子果实。,E、获三倍体或单倍体植株,F、快速繁殖特殊植物(椰子，山楂） G、用于基础研究 研究胚胎发育过程、胚胎发生的条件以及影响因素，胚乳生长发育及形态建成过程。,类型： （1）成熟胚培养 （2）幼胚培养 双子叶植物胚的发育途径 原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体,成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。 它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。由于种子外部有较厚的种皮包裹
15、，不易造成损伤，易于进行消毒，因此，将成熟或未成熟种子用70%酒精进行几秒种的表面消毒，再用无菌水冲洗3-4次，然后在无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。,幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来越深入和广泛。 幼胚培养的发育途径： 胚性发育(embryonal development)、早熟萌发(Precocious germination)、愈伤组织(callus),(一) 材料的选取与灭菌 取材：大多数幼胚培养成功的实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚。以幼胚抢救为目的的胚培养取材，必须在胚退化
16、衰败之前。 灭菌：消毒程序,(A) globular (B) heart shaped, (C) torpedo,二、幼胚培养,（二）幼胚剥离及培养 幼胚的剥离胚剥离的成功与否是幼胚培养成功与否的关键。幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。有关胚发育的细胞学和生理生化研究表明，胚柄积极参与幼胚的发育，特别是球形期以前的幼胚培养，胚剥离时应带胚柄。另外胚柄促进幼胚离体生长的作用能被浓度为5mg/L的GA有效取代。,幼胚的培养培养条件的控制（是否需要特殊处理） 剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。在培养之前必须对所培养的对象在自然发育条件下的
17、特性充分了解，比如胚的休眠问题、是否需要春化作用、胚萌发的温度等。,（三）影响离体胚培养的因素 培养基中的无机盐 胚的成熟程度不同，所用培养基的类型也不同。 成熟胚的培养基有：Tukey、White等。 未成熟胚有：Rijven、Nitch、MS等。,培养基中的碳水化合物 渗透压对幼胚培养至关重要，渗透压的调节主要依赖糖。常用的是蔗糖，不同发育时期的胚要求蔗糖的浓度不同，胚龄越小糖浓度要求越高。确定适宜蔗糖浓度的方法是在接种前将幼胚剥出后放入若干浓度的蔗糖溶液中，观察质壁分离现象，以确定等渗溶液的浓度。,附加物： a、AA类，无论是单一的还是复合的AA都能刺激胚的生长。最有效的是Gln，常用的
18、有Gly、Ala、Glu、Asp。CH是一种AA复合物，有抑制早熟萌发和促进未成熟胚发育的作用 b、维生素类。维生素对初期幼胚一般是必需的，但有时也有抑制作用，最好在实验证实后使用。 c、天然提取物。常用各种胚乳汁、酵母提取物 d、生长调节剂,环境条件 对于幼胚培养，初期弱光和黑暗更适宜，幼胚启动发育后给予和其自然光周期一致的光照条件有利于幼胚发育。 培养的温度一般以该植物种子萌发的适宜温度为好。,培养材料 植物培养材料的基因型和胚发育程度对离体胚培养有重要影响。显然，材料基因型不同，胚培养的难易程度也不同。 胚发育阶段以越幼嫩的胚越难以培养。,胚柄 胚柄的存在对于幼胚的存活至关重要： 胚柄促
19、进生长的活性，心形早期活性最高。而且保留胚柄减少对胚的直接损失。,第二节 植物胚乳培养 ( endosperm culture) （自学）,1定义及概况 定义：是指将植物的胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。 概况：胚乳培养的研究主要集中在以下一些问题的探讨： A、胚乳细胞的全能性。 B、能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实； C、研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。,Triticum grain,到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的
20、分化出芽、根、叶等或得到愈伤组织。,Plantlets arising from isolated endosperm tissue,2. 胚乳培养过程,胚乳,胚状体发育成苗不定芽苗,柚，柑桔和枣,大麦, 水稻, 玉米, 苹果, 马铃薯,形态特征：无籽、粗壮、叶片大而肥厚、叶色浓、花大或重瓣、果实大但结实率低。 倍性：易出现染色体倍性混乱现象。但有些表现出稳定性。 影响染色体稳定性的因素：胚乳类型、胚乳愈伤组织发生的部位、培养基中外源激素的种类和水平。,3. 三倍体后代的特征,1材料的选择 （1）品种间的差异 （2）胚囊发育时期：以八核胚囊和成熟胚囊期的子房培养具有较高的诱导频率。,2培养基
21、（1）基本培养基 不同培养基对于子房培养产生愈伤组织的诱导率有直接影响，比较常用的培养基是N6、BN、MS，禾本科作物以N6培养基较常用，其它植物则多用MS和BN。,（2）植物生长调节物质的影响 未授粉的子房培养必须加入适宜种类和浓度的植物生长调节物质 （3）蔗糖浓度 蔗糖浓度多在310之间，因不同植物材料而异，一般是诱导培养阶段蔗糖浓度要高一些，分化培养时蔗糖浓度要低一些。,3.接种方式 主要考虑两个方面的问题：极性；营养吸收 花柄直插比平放效果好,一、离体授粉的概念和意义 概念： 指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术，
22、又称为离体受精，或试管受精。,4. 植物的离体授粉, 离体受精技术可克服自交不亲和； 克服远缘杂交障碍，特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后不能进入花柱，或在花柱中生长缓慢，使配子不能如期融合方面有着极其重要的意义。 另外，试管受精技术也为外源特异基因的有性转移，诱导遗传变异开辟了一条新途径。 可以诱导孤雌生殖。,意义：,二、离体受精的方法 （一）收集花粉 参照花粉培养 （二）剥取子房或胚珠 做母本的花蕾在开花前数天去雄并套袋，开花前一天取花蕾在实验室进行常规表面消毒之后，在无菌条件下剥取胚珠（带胎座或不带胎座）或子房培养。,（三）离体受精的方法,1.离体柱头授粉 接近自然授粉的试管受精技术。
23、烟草、金鱼草、玉米,2.子房试管授粉 直接引入法 无菌条件下用锋利的刀片将子房壁或子房顶端切开一个小口，把花粉悬浮液直接滴入切口后进行培养。 注射法 用无菌注射器吸取花粉悬浮液，从子房基部或上端切口注入子房，基部切口可用凡士林封口，然后接种于培养基上。花粉的悬浮液是已收集的无菌花粉，用10-20mg/L浓度的硼酸溶液加5%蔗糖配制而成，每滴约含花粉100-300粒。,3.胚珠试管受粉 胚珠剥离后可以从胎座上切下单个胚珠授粉，也可将带着完整胎座或部分胎座的胚珠接种到培养基上，并撒播花粉。 哺育法 将胚珠表面先蘸满有助于花粉萌发的培养基，然后在胚珠上撒播花粉使之受精，这一方法是解决胚珠存活率和花粉
24、发芽，花粉管伸长培养基发生矛盾时的做法 柱头接近法 将花粉撒在本种植物的柱头上，切下柱头接种在培养基上。然后在柱头周围，接种异种裸露胚珠，花粉在本种植物柱头的哺育下发芽，伸长并进入胚珠受精,1、离体胚珠的成活力和受精力 试管受精的成功率与胚珠的成活率有着密切的关系。提高离体胚珠成活率的关键是培养基。因此要对培养基的各种成分进行详细的筛选。诸如基本培养基、植物生长调节剂的种类和浓度、渗透压、pH等。,三、离体受精成功的技术关键,2花粉萌发和花粉管的生长速度 试管内撒粉以后如何保证花粉迅速发芽，花粉管能迅速伸长并在受精允许的时间内达到胚囊，关键仍然是培养基，因此需对花粉萌发和花粉管伸长的适宜培养基进行筛选。 3、亲本组织的影响,
