1、一、盐析,盐析：溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程 向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，是物理变化，可复原。,（一）基本原理蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等参数的影响。,蛋白质在自然环境中通常是可溶的，表面：大部分是亲水基团内部：大部分是疏水基团,蛋白质呈稳定的分散状态,两性物质，一定pH下表面带有一定的 电荷，静电斥力作用使分子间相互
2、排斥,蛋白质周围的水分子有序排列，在表面形成水化膜，这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。,当向蛋白质溶液中加入中性盐时：,低盐-盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大),高盐-盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小),盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间排斥作用减弱,中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化作用从而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域,H+,OH-,中性盐 破坏水膜,蛋白质的盐析机制示意图,蛋白质沉淀,蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影响更显著。通常用离子强度表示对盐析的影响。,碳氧血红蛋白的lgS与
3、(NH4)2SO4离子强度的关系,S0,(离子强度),lgS,盐析,盐溶,蛋白质溶解度,起始蛋白浓度,（二）无机盐的选择,在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4, Na2SO4， MgSO4，NaH2PO4，NaCl， Na3PO4, K3PO4。,(NH4)2SO4原因,廉价 在水中溶解度大，且溶解度随温度变化小，低温下仍具有较大的溶解度 对大多数蛋白质的活力无损害,常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml水）,盐析效果：阴离子 阳离子 尤其以高价阴离子更为明显。,阳离子对盐析效果的影响： Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb+ NH4+ K+ Na+ Li+
4、,无机盐可按两种方式加入溶液中：,直接加入固体(NH4)2SO4粉末工业生产(分批加入，充分搅拌) 加入(NH4)2SO4饱和溶液实验室和小规模生产(防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释),（三）影响盐析的各种因素,无机盐的加入量 蛋白质的浓度 温度 pH 操作方式,1.无机盐加入量的影响,S0,(离子强度),lgS,盐析,蛋白质溶解度,不同蛋白质溶解度与离子强度的关系,蛋白质种类不同，盐析所用的无机盐量也不同,对于特定的蛋白质，一定操作条件下产生沉淀时的无机盐浓度范围都是一定的，即具有一定的蛋白质盐析分布曲线。,蛋白质沉淀的速度可用 - 对盐饱和度（P）作图来表示：,dS,dP,蛋白质
5、溶解度随(NH4)2SO4 饱和度而变化的速率,P,利用不同蛋白质盐析分布曲线在横轴上的位置不同，可采取先后加入不同量无机盐的办法来分级沉淀蛋白质。,2.蛋白质浓度的影响,蛋白质浓度不同，沉淀所需无机盐用量也不同。随浓度提高，盐用量减少。,分级沉淀： 将溶液稀释，使重叠曲线拉开距离 制取成品： 提高蛋白质浓度,3.温度的影响,低盐浓度：温度升高，溶解度升高 高盐浓度：温度升高，溶解度降低,温度适当提高有利于蛋白质沉淀。高温容易导致蛋白质变性。蛋白质盐析一般在室温下进行，某些温度敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。,4.pH的影响蛋白质在pI时的溶解度最小，最容易从溶液中析出，因此选择在被盐析的
6、蛋白质的pI附近。耗盐少，蛋白质收率也高,5.操作方式的影响,10,50 60 70 饱和度（%）,5,2.5,1,酶活性 U/ml,操作方式对延胡索酸酶盐析的影响,采用间歇方式所需盐量比连续方式少； 间歇操作中，用饱和溶液的需盐量比用固体盐的高。,6.盐析法的优缺点,（1）优点： 室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活； 非蛋白的杂质很少被夹带沉淀； 适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 设备简单，操作方便。,（2）缺点： 沉淀物中含有大量盐析剂 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上,盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。,
