1、油 脂工程 T echnique 技术2011.02产 油微藻油脂代谢调控尚常花 朱顺妮 袁振宏 王忠铭（中国科学院广州能源研究所 ， 中国科学院可再生能源与天然气水合物重点实验室 ）【摘要 】 富含油脂的微藻被认为是一种有前途的生物柴油制备原材料 。 与油料作物相比较 ，藻类作为生物柴油原材料的优势包括较高的光合作用效率 ， 较大的生物量以及对环境的广泛适应性 。 随着微藻生物技术的快速发展 ， 人们对通过基因工程来获得高油脂含量微藻的兴趣日益增加 。 简要综述了产油微藻中的油脂代谢调控 ， 同时对产油微藻代谢调控的前景进行了展望 。【关键词 】 微藻 ； 基因工程 ； 代谢调控 ； 生物柴
2、油中图分类号 ： TS 225 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1000-9868(2011)02-0057-05作为一种可再生能源 ， 生物柴油的应用前景非常广阔 。 目前生物柴油的原料主要是油料作物 ， 限制了生物柴油生产的进一步发展 。 含油微藻被认为是一种有潜力的生物柴油新型原料 ， 但是微藻油脂单位光照面积产量低 ， 生产成本过高 ， 如何提高藻体内油脂含量成为研究重点 。 本文比较了通过生化途径和基因工程途径提高微藻油脂含量的研究进展 ， 并对其发展前景进行了展望 。1 微藻作为制备生物柴油原料的优势微藻作为制备生物柴油的新型原料 ， 具有如下优势 ：（1） 可以合成和积累大量的
3、油脂 ； （2） 具有较高的生长速率 ； （3） 可以生长在盐湖 、 海水 、 淡水等多种生态环境中 ； （4） 可以在不适合发展传统农业的边缘土地 （如沙漠 、 干旱和半干旱地区 ） 生长 ； （5） 可以从多种废水（如工业废水 、 生活废水等 ） 中获取生长所需的氮源和磷源等营养物质 ， 同时对废水进行生物修复 ； （6） 可以利用 CO2， 减少温室气体的排放 ， 改善气候 ； （7） 可以产生多种有附加值产品 （如蛋白质 、 多糖 、 色素 、 动物饲料 、 肥料等 ）。然而 ， 目前利用微藻制备生物柴油还面临着成本过高等难题 。 面对这些挑战 ， 研究人员通过生化途径和基因工程途径对
4、微藻的油脂积累进行了深入的研究 。2 生化途径在理想的生长条件或有利的环境下 ， 产油微藻仅仅产生少量的三脂酰甘油 （TAG）。 当产油微藻处在由化学或者物理环境刺激造成的不利条件下的时候 ， 就会大量合成 TAG， 同时伴随着油脂和脂肪酸组分的显著改变 。主要的化学刺激包括营养物限制 、 盐度和生长基质的 pH值 。 主要的物理刺激包括温度和光照强度 。生化途径是一种通过控制营养或培养条件 （如温度 、培养基 pH 值和盐度 ） 将光合作用产生的代谢流更多地导向脂类的生物合成来增强油脂产量的途径 。 到目前为止 ， 在微藻中营养物限制是最常用的将代谢流导向脂类合成的方法 。 研究表明 ， 在
5、营养物受限 ， 而碳源非常丰富的情况下 ， 微藻会将大量的碳源转化为储藏脂类 ， 主要是 TAG。 在所有的营养物中 ， 氮源是广泛使用的最重要的影响微藻油脂积累的营养物 。在微藻的许多物种中 ， 都观察到了氮源限制导致油脂积累的现象 。 小球藻属 （Chlorella） 通常积累淀粉作为储藏物质 。 然而 ， 2000 年 ， Illman 等人发现在低氮培养基中 4 种小球藻浮水小球藻 Chlorella emersonii、 微小小球藻 Chlorella minutissima、 普通小球藻 Chlorella vulgaris和蛋白核小球藻 Chlorella pyrenoidosa
6、 可以积累占细胞干质量比例分别为 63、 57、 40 和 23 的油脂 。在硅藻中 ， 硅源是同样重要的影响脂类代谢的营养物 。 Roessler 发现在硅源限制的培养条件下 ， 隐秘小环藻Cyclotella cryptica 细胞可以积累高水平的中性油脂 （主要是 TAG）， 含有高比例的饱和和单不饱和脂肪酸 。除了氮源和硅源外 ， 可以影响油脂积累的营养物还有磷酸盐和硫酸盐 。 KhozinGoldberg 和 Cohen 发现在蒜头藻 Monodus subterraneus 中 ， 磷源限制可以导致细胞油脂 （主要是 TAG） 含量增加 。 除了营养物限制之外 ， 在微藻中 ， 其
7、他的不利条件也可以促进油脂的积累 。 Takagi57DOI:10.16167/ki.1000-9868.2011.05.009技 术 T echnique油脂工程2011.02等人在研究盐度对嗜盐微藻 Dunaliella 细胞中油脂和TAG 含量的影响时 ， 发现高于 15molL 的起始 NaCl 浓度会显著抑制细胞的生长 。 但是 ， 当起始 NaCl 的浓度从05molL 升高至 10molL 时 ， 细胞内油脂含量从 60升高至 67。然而 ， 采用生化途径来提高油脂含量的方法存在很大的局限性 。 因为营养物限制或生理逆境等在增加细胞油脂含量的同时 ， 也会抑制细胞分裂 ， 导致生
8、物量下降 。Scragg 等人比较了小球藻 C vulgaris 和 C emersonii 生长在 Watanabe 培养基和低氮培养基上的能量回收情况 ， 发现尽管低氮培养基促进了两种小球藻油脂的积累 ， 但是 ，生长在低氮条件下的小球藻 ， 其总的能量回收却低于生长在 Watanabe 培养基中的小球藻 。利用两阶段培养法可以充分发挥通过生化途径提高油脂含量的潜力 ， 通常第一阶段让微藻细胞在富含营养物的培养基中进行充分地生长和繁殖 ， 第二阶段将微藻置于营养物限制或其他生理逆境条件下使其大量积累油脂 。 研究人员认为封闭式光生物反应器 开放式池塘联合培养系统是一种有潜力的使用两阶段策略
9、培养微藻的解决办法 。 在封闭式光生物反应器内利用富含营养物的培养基使微藻大量生长和繁殖 。 然后将这些微藻放入低氮的开放式池塘中进行油脂的积累 。由于许多常用限制性营养物对于光合作用是必需的 ，因此营养物限制虽然可以提高细胞油脂含量 ， 但是会减弱微藻的光合作用 ， 导致生物量减少 。 总之 ， 通过生化途径来提高油脂产量存在很大局限性 ， 即便可以提高 ，其提高的幅度也很小 。3 基因工程途径基因工程 （genetic engineering） 是指在体外将外源基因插入病毒 、 质粒等载体分子 ， 构成重组 DNA 分子 ，然后将重组 DNA 分子导入受体细胞内 ， 使外源基因能够在受体细
10、胞内进行复制 、 转录和翻译表达的分子水平的操作技术 。 利用基因工程技术进行新品种培育的育种方法称为基因工程育种 。 与杂交育种 、 诱变育种等方法相比较 ， 基因工程育种因其可以定向改变生物性状 ， 还可以节省更多的时间 ， 日益引起研究人员的关注 。随着微藻生物技术的迅速发展 ， 人们对微藻转基因的商业化应用的兴趣日益增加 。 一些微藻的基因组测序已经完成 ， 包括红藻原始红藻 Cyanidioschyzon merolae、硅藻假微型海链藻 Thalassiosira pseudonana、 单细胞绿藻Ostreococcus tauri 和团藻 Volvox carteri 等 。
11、一些微藻的核转化已经比较成熟 ， 绿藻 、 红藻和裸藻的叶绿体转化已经取得成功 。 在绿藻莱茵衣藻 Chlamydomonas reinhardtti和 V carteri 中已经发展了各种基因转化系统 。尽管 ， 在微藻中通过基因工程途径来实现油脂的超量生产尚未有成功的报道 。 但是 ， 研究人员正在通过该途径在不同生物中进行增强脂类产量的试验 ， 这些结果为微藻转基因研究提供了重要的背景知识 。 目前 ， 通过基因工程途径来增强油脂产量主要包括如下 3 个方面的研究 ： 超量表达 TAG 生物合成途径的酶 、 超量表达与油脂生物合成相关的酶和阻碍竞争代谢途径 。31 油脂生物合成途径概述在
12、细胞中 ， TAG 总体的合成途径包括 3 个主要步骤 ：（1） 乙酰辅酶 A 羧化酶 （acetylCoA carboxylase， AC-Case） 催化乙酰辅酶 A 羧化形成丙二酸单酰辅酶 A， 它是脂肪酸生物合成途径的关键步骤 ； （2） 脂酰基链延长 ； （3） TAG 形成 。在 E coli 中 ， ACCase 包含分别由不同基因编码的 4个亚基 。 在植物体内有两种同工型的 ACCase， 分别位于质体和细胞质中 ， 脂肪酸合成完全在发育种子的质体中进行 。 大多数植物质体中的 ACCase 结构与 E coli AC-Case 同属于原核类型 ACCase， 而细胞质中的
13、ACCase 是由单条包含多个功能域的多肽链组成的蛋白质 ， 属于真核类型 ACCase。丙二酸单酰辅酶 A 合成后 ， 在丙二酸单酰辅酶 A：ACP 酰基转移酶的作用下 ， 被转移到脂肪 酸 合 成 酶（FAS） 多酶复合体的酰基载体蛋白 （ACP） 上 。 细菌和植物具有 II 型 FAS， 它是一个多亚基蛋白 。 与此相反 ，在酵母和脊椎动物中具有 I 型 FAS， 它是一个多功能蛋白 。 FAS 催化脂肪酸碳链延长 ， 最终生成含 16 个或 18个碳原子的软脂酸和硬脂酸 ， 然后经过定位于内质网膜和线粒体上的延伸酶和去饱和酶的作用 ， 生成各种更长碳链和不饱和的脂肪酸 。真核生物的
14、TAG 在定位于内质网上的特定细胞器（线粒体 、 质体 ） 中生成 ， 而原核生物的 TAG 在细胞质中合成 。 在微藻中 ， TAG 的生物合成经过 4 步反应 ， 催化反应的酶依次为酰基 CoA： 甘油 3磷酸酰基转移酶 、酰基 CoA： 溶血磷脂酸酰基转移酶 、 磷脂酸磷酸酶 、 酰基 CoA： 二酰基甘油酰基转移酶 。 虽然上述 4 步反应构成的途径被认为是 TAG 合成的主要途径 。 Dahlqvist 等人发现在一些植物和酵母中 ， 还有一个不依赖于酰基 CoA58油 脂工程 T echnique 技术2011.02的 TAG 生物合成机制 。 该途径以磷脂作为酰基供体 ， 二酰基
15、甘油作为酰基受体 ， 催化此反应的酶为磷脂 ： 二脂酰甘油酰基转移酶 （PDAT）。32 超量表达 TAG 生物合成途径的酶321 乙酰辅酶 A 羧化酶 ACCase1994 年 ， Page 等人发现在植物中 ACCase 对脂肪酸合成的代谢流发挥着强烈的控制作用 ， 此后 ， 研究人员就开始在不同的物种中对该酶进行超量表达以增强油脂的产量 。 Dunahay 等人成功地将 C cryptica 的 ACC 基因转化到硅藻 C cryptica 和舟形藻 Navicula saprophila 中 ，发现 ACCase 的活性提高至对照的 23 倍 ， 然而 ， 油脂积累没有显著增加 。 D
16、avis 等人克隆了 E coli BL21 中编码 ACCase4 个亚基的基因 ， 并将它们在同样的菌株中进行超量表达 ， 发现 ACCase 酶活增强 ， 丙二酸单酰辅酶 A的水平增加了 100 倍 ， 而脂肪酸合成速率仅为对照的 6倍 ， 油脂产量没有显著变化 ， 表明在此菌株中 ACCase 确实是脂肪酸生物合成的限速酶 ， 同时可能存在另一个位于脂肪酸合成途径之后的限速步骤 ， 阻碍了脂肪酸转变为油脂 。综上所述 ， 我们推测超量表达 ACCase 时油脂含量没有显著增加的原因可能有 ： （1） 在某些特定物种中 ，ACCase 并不是脂肪酸合成途径的限速酶 ； （2） ACCas
17、e超量表达后 ， 出现了另外的限速步骤 。 然而 ， Klaus 等人将来自拟南芥的真核类型 ACC 基因在马铃薯 Solanumtuberosum L中进行了超量表达 ， 结果显示总脂肪酸含量比对照增加了 30， TAG 含量为对照的 5 倍 。 试验结果表明 ： 在马铃薯中 ACCase 是脂肪酸合成的限制因素 ， 且增加的脂肪酸优先用于合成 TAG。 这些充分显示了对ACCase 调控的复杂性 。 有关在微藻中超量表达真核和原核类型 ACC 的报道还非常少 。 由于真核和原核类型 AC-Case 在结构和功能上都有显著区别 ， 我们推测 ， 超量表达来自微藻的原核类型 ACC 可能会极大
18、地增加微藻中脂肪酸的合成速率 。322 脂肪酸合成酶 FAS细菌和植物的 FAS 是一个多亚基蛋白 ， 研究人员针对其某些亚基进行了超量表达试验 。 Dehesh 等人将来自菠菜 （Spinacia oleracea） 的 KASIII 亚基在烟草 （Nico-tiana tabacum）、 拟南芥和油菜 B campestris 中进行了超量表达 ， 发现油脂合成速率下降 ， 脂肪酸 （16： 0） 积累增加 。 超量表达 FAS 的亚基并没有导致脂肪酸合成的增加 ， 可能是因为其活性的提高依赖于每一个亚基水平的提高 。323 酰基 CoA： 溶血磷脂酸酰基转移酶 （LPAT）Zou 等人将
19、酵母推测的编码 sn2 acyltransferase 的基因在甘蓝型油菜 Brassica napus 中进行超量表达 。 结果发现转基因油菜种子中 LPAT 活性提高 ， 油脂含量为对照的 6 倍 ， 表明超量表达 LPAT 可以显著提高油脂含量 ，为微藻转基因操作中目标基因的选择提供了方向 。324 酰基 CoA： 二酰基甘油酰基转移酶 （DGAT）DGAT 催化 TAG 合成的最后一 步 反 应 。 BouvierNave 等人将拟南芥的 DGAT 基因分别在酵母和烟草 Ntabacum 中进行了超量表达 ， 发现在转基因酵母中 ，DGAT 活性增加了 200600 倍 ， TAG 的
20、含量为对照的 39倍 。 在转基因烟草中 ， TAG 的含量为对照烟草的 7 倍 。超量表达 DGAT 可以显著提高 TAG 含量 ， 可能是因为 DGAT 的底物二酰基甘油既可以合成 TAG， 也可以合成磷脂 ， 超量表达 DGAT 会使得二酰基甘油更多地用于TAG 的合成 。 综上所述 ， DGAT 催化的反应可能是油脂合成中重要的限速步骤 ， DGAT 是通过基因工程手段提高油脂含量时有很大潜力的目的基因 。 然而 ， 目前尚没有在微藻中超量表达 DGAT 的报道 。33 超量表达与油脂生物合成相关的酶细胞中各种代谢网络相互交织和作用 。 有一些酶尽管不直接参与油脂的生物合成 ， 但是
21、， 其催化反应的产物能提供油脂生物合成过程所需的重要中间代谢物 ， 进而影响油脂的合成速率 。 常见的与油脂生物合成相关的酶有苹果酸酶 （ME）、 ATP： 柠檬酸裂合酶 （ACL） 等 。ME 催化苹果酸生成丙酮酸 ， 同时还原一分子NADP生成 NADPH。 NADPH 可以作为还原力和能量 ，它对于脂肪酸的生物合成过程是必要的 。 除了 ME， 没有其他酶可以产生脂肪酸合成所必需的还原力 NADPH。Wynn 等人以卷枝毛霉 Mucor circinelloides 作为模型生物 ，使用特异性抑制剂芝麻酚抑制 ME 的活性 ， 发现油脂含量从 25降至 2， 而对生长没有不利的影响 。
22、此外 ， 油脂积累期间 ， 在 M circinelloides 和高山被孢霉 Mortierellaalpina 中发现当 ME 活性完全丧失的时候 ， 油脂积累也停止 。 上述结果表明 ， 在产油真菌中 ME 催化的反应可能是脂肪酸合成的限速步骤 。 Zhang 等人将来自 M circinel-loides 和 M alpina 的 ME 基因 malEMc 和 malEMt 在 Mcircinelloides 中超量表达 。 在转 malEMt 和 malEMc 的转基因菌株中 ， ME 的活性分别为对照的 3 倍和 2 倍 ， 与此同时 ， 合成油脂的总量分别为对照的 24 和 25
23、 倍 。59技 术 T echnique油脂工程2011.02ACL 催化柠檬酸转变成乙酰 CoA 和草酰乙酸 ， 因此也是脂肪酸生物合成所需乙酰 CoA 的一个来源 。 在哺乳动物 、 产油真菌和酵母中 ， ACL 被认为是一个调控油脂积累的关键酶 。 Rangasamy 和 Ratledge 将小鼠的 ACL 在烟草中超量表达 ， 发现总的 ACL 活性比对照增加了 4倍 ， 脂肪酸含量与对照相比增长了 16。34 阻碍竞争途径从代谢工程的观点来看 ， 阻碍竞争途径也可以使更多的代谢流用于 TAG 的生物合成 。 主要的竞争途径有 ：氧化 、 磷脂生物合成 、 磷酸烯醇式丙酮酸 （PEP）
24、 转变为草酰乙酸的反应和淀粉的合成 。在真核生物中 ， 氧化是最重要的负责脂肪酸降解的代谢途径 ， 它消耗了 TAG 生物合成的前体物质脂肪酸 。 因此 ， 研究人员计划通过抑制该途径来增强 TAG 的合成 。磷脂的生物合成是 TAG 合成的另一竞争途径 ， 因为这两条途径竞争共同的底物磷脂酸 。如果磷脂酸被转化成 CDP二酰基甘油 ， 它就会进入磷脂合成途径 。 前面提到通过超量表达 DGAT， 就可以使磷脂酸更多地用于合成 TAG。第 3 个竞争途径是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC） 催化 PEP 生成草酰乙酸的反应 。 因为 PEP 也是TAG 生物合成中的重要前体物质 ， 它经酶催化
25、依次转化为丙酮酸 、 乙酰 CoA、 丙二酸单酰 CoA 和脂肪酸 。 1999年 ， Chen 等人通过在油菜中超量表达反义 PEPC， 使得油脂含量增加了 6418， 表明降低 PEPC 活性有助于油脂积累 。第 4 个竞争途径是淀粉的合成 。 Li 等人发现在野生型莱茵衣藻中 TAG 含量仅为 2， 而在淀粉合成受阻的突变株 BAFJ5 中 ， TAG 的含量高达 25。 结果表明通过抑制淀粉的合成可以增强油脂和 TAG 积累 。4 微藻油脂代谢调控展望综上所述 ， 油脂代谢调控的重心将逐步由生化方式调控转向基因工程方式调控 。 ACCase、 LPAT、 DGAT、ME、 ACL、 P
26、EPC、 AGPase 的小亚基都是重要的调控对象 。 微藻转基因现在面临的问题有 ： 源自微藻的目的基因还很少 ， 微藻来源的启动子还很少 ， 对微藻的代谢网络调控理解还不够深入 ， 微藻的多基因转化尚不够成熟 。随着微藻基因工程技术的发展 ， 将会有更多微藻的油脂代谢调控相关基因被克隆和超量表达 ， 为筛选高油脂含量微藻奠定基础 。 前面提到在营养物受限 ， 而碳源非常丰富的情况下 ， 微藻会将大量的碳源转化为储藏脂类 。因此 ， 我们计划增强微藻的光合作用 ， 观察其对油脂积累的影响 。 目前我们已克隆了编码巴夫杜氏藻 Dunaliellaparva 核酮糖 1， 5二磷酸羧化酶 加氧酶
27、 （光合作用中的关键酶 ） 小亚基的 rbcS 基因的 cDNA （GenBank acces-sion no HQ315783 ） 和启动子序列 。 下一步将利用 rbcS基因的启动子驱动 rbcS 基因在微藻中的超量表达 ， 观察其对光合作用和油脂积累的影响 。参 考 文 献 1 Illman A M， Scragg A H， Shales S W Increase in Chlorellastrains caloric values when grown in low nitrogen medium J Enzyme and Microbial Technology， 2000 （27）
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40、价油脂生物柴油清洁生产工艺 。通信地址 ： （510640） 广东省广州市天河区五山能源路 2 号茶树菇油脂的提取及其脂肪酸组成分析研究王建伟 陈武强 杨海文 赵雪名 田光辉（陕西理工学院化学学院 ）【摘要 】 用超声波辅助提取法提取茶树菇中的油脂 ， 并用正交试验优化确定油脂的提取最佳工艺条件 。 将油脂水解后再进行甲酯化 ， 利用气相色谱 质谱联用技术 （GCMS） 检测其中的脂肪酸组成及相对含量 。 结果表明 ： 茶树菇油中含有 13 种脂肪酸 ， 其中饱和脂肪酸 8 种 ， 不饱和脂肪酸 5 种 ， 不饱和脂肪酸含量占到总脂肪酸的 4370， 茶树菇油中脂肪酸主要是亚油酸 （2208）
41、、油酸 （903）、 亚麻酸 （722） 等 ， 茶树菇油有很好的开发利用价值 。【关键词 】 茶树菇 ； 超声波 ； 脂肪酸 ； GCMS中图分类号 ： TS 2251 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1000-9868(2011)02-0061-03茶树菇 （Agrocybe cylindracea） 属于担子菌亚门层菌纲伞菌目粪锈伞科田头菇属是一种木生食用菌 ， 又名柱状田头菇 、 杨树菇 、 茶薪菇 、 柱状环绣伞等 ， 生长于温热带至亚热带地区 ， 其盖嫩柄脆 、 味道鲜美 、 气味香浓 、 营养丰富 ， 是食用价值很高的真菌之一 。 同时具有很好的药用价值 ， 茶树菇具有清热 、 平肝 、 明目 、 利尿 、健脾之功效 ， 有 “中华神菇 ” 之称 。 人们对茶树菇中的生物活性成分进行了大量的研究 ， 主要集中在茶树菇中的多糖 、 矿物质元素 、 蛋白质和氨基酸等方面 ， 对其油脂成分方面的研究尚未见具体的文献报道 ， 实际上食用菌里含有大量的脂溶性成分 ， 有可开发利用价值 。 这里采用超声波辅助提取法 ， 对影响茶树菇粗脂肪提取的各因素水平条件进行筛选 ， 采用正交试验进一步确定最佳提取工艺条件 ， 并对提取的油脂进行皂化 、 甲酯化处理 ，最后用 GCMS 进行成分分析 ， 可为茶树菇综合开发利用提供参考 。61
