1、1分子克隆技术实验操作手册分子克隆技术实验操作手册 分子克隆技术是指 DNA 的无性繁殖技术。分子克隆技术课程主要是针对生物技术专业、生物科学专业、生命科学与技术基地班本科生及生物学类专业研究生而开设的实验课。实验内容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆和分子杂交两大部分：分子克隆技术：DNA 重组技术是分子生物学的核心内容。本实验利用质粒载体克隆外源DNA 片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源 DNA 的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等。分子杂交技术：实验室常用的分子杂交技术主要有 Southern blott
2、ing，Northern blotting，Western blotting 及 Dot blotting 等。Southern blotting 是通过用一种或多种限制性内切酶消化基因组或其它来源的 DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后 DNA 在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（硝酸纤维素膜或尼龙膜） 。DNA 转移至固相支持物的过程中各 DNA 的相对位置保持不变，用一定方法(如放射性同位素)标记的 DNA 探针与固着在膜上的 DNA 杂交，经 X-光片自显影显现出与探针 DNA互补的 DNA 电泳条带的位置，然后进行分析。本实验要求掌握植物总 DNA 的抽提
3、、质量检测、限制性内切酶操作、DNA 的琼脂糖凝胶电泳、转膜、探针的制备、同位素操作等方面的实验技术。在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。为让学生初步了解有关 RNA 的操作过程注意事项，我们还列出 Northern blotting的操作步骤以供选择。目 录系列一 分子克隆技术 4实验一 质粒的制备 4实验二 DNA 的琼脂糖凝胶电泳 5实验三 外源 DNA 片段在质粒载体中的克隆 7实验四 感受态细胞的制备 9CaCl2 感受态细胞的制备实验步骤 9电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤 10实验五 质粒的转化及转化子的鉴定 11热激法转化实验步骤：
4、11质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 12实验六 PCR 技术 12系列二 Southern 杂交技术 14实验一 植物总 DNA 的快速少量抽提（CTAB 法） 14实验二 总 DNA 质量检测及酶切 15实验三 电泳、转膜 16实验四 Southern Blotting 18系列三 Northern Blotting 24实验一 RNA Extraction (mini prep) 24实验二 RT-PCR (Reverse transcription PCR) 26实验三 RNA 的电泳，转膜和杂交 28附录 试剂配方 29一 细菌培养试剂 30二 质粒抽提试剂 30三 DNA 操作
5、试剂 31四 RNA 操作试剂 34Stock Solution: 34Work Solution 35系列一 分子克隆技术实验一 质粒的制备质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。质粒的提取方法很多，大多包括 3 个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA 的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。实验材料：含有质粒 pUC18 载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的 BAC 的大肠杆菌菌液。 实验原理：在 pH 12.0 12
6、.6 碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体 DNA 变性分开，而共价闭环的质粒 DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将 pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体 DNA、大分子量的 RNA 和蛋白质在去污剂 SDS 的作用下形成沉淀，而质粒 DNA 仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA 及蛋白质，质粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒2DNA。实验步骤：1. 取含有 pUC18 质粒的大肠杆菌菌液于 LA 培养基上 37过夜培养；2. 用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有 Amp 抗生素的 LB 培养基中， 37摇床250 r/m
7、in 过夜培养；3. 吸取 1.5 ml 菌液，12000 g 离心 2 分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取 1.5 ml 菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；l 溶液 4. 加入 300 I 振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块） ； 5. 加入 300 l 溶液 II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过 5 分钟；6. 加入 300 l 溶液 III 颠倒混匀，放置于冰上 10 分钟，使杂质充分沉淀；7. 12000 g 离心 10 分钟；8. 吸取 800 l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一 Eppendorf 管中，加入2/3 体积的异丙醇，室温下放
8、置 5 分钟；9. 12000 g 常温离心 15 分钟；10. 倒尽上清，加 75乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心 3 分钟后倒去上清） ；11. 室温放置或超净台上风干 DNA；l 灭菌超纯水或 TE 溶解；12. 加 40 13. 质粒、BAC 的质量检测，于-20保存。附注：质粒检测电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型吸光值检测：采用分光光度计检测 260nm、280nm 波长吸光值，若吸光值260nm/280nm 的比值介于 1.71.9 之间，说明质粒质量较好，1.8 为最佳，低于 1.8说明有蛋白质污染，大于 1.8 说明有 RNA 污染。实验二 D
9、NA 的琼脂糖凝胶电泳带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，学习琼脂糖凝胶电泳的操作。实验材料：质粒 DNA、BAC、植物总 DNA 或它们的酶切产物。实验原理：在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其
10、大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。实验步骤：1 用胶带将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上；2 调整好梳子的高度；3 称取 0.24 g 琼脂糖于 30 ml 0.5TBE 中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至 45-50 篊时倒入制胶板中；4 凝胶凝固后，小心拔去梳子，撕下胶带；5 将电泳样品与溴酚蓝混合后将样品依次点入加样孔中；pUC18 5 祃 + ddH2O 3 祃 + 溴酚蓝 2 祃 共 10 祃于 0.5ml tube 中混合后点样；6 将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动；7
11、电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入 0.5 礸/ml 的溴化乙锭（EB）溶液中染色1015 min，清水漂洗后置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。附注：1影响 DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：1) DNA 分子大小 迁移速率 U 与 logN 成反比（N 为碱基对数目） 。分子大小相等，电荷基本相等（DNA 结构重复性） 。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋线性 DNA）2) 胶浓度，U 为迁移率，U0 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr 为胶浓度，Kr 为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的 DNA为 DNA 的自由电泳迁移率，Agarose： 0
12、.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.3) DNA 构象：一般迁移速率超螺旋环状线状 DNA单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及 EB 含量有关。4) 所加电压：低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过 5V/cm5) 碱基组成与温度：一般影响不大 4 -30 6) 嵌入染料的存在：降低线性 DNA 迁移率，(不提倡加在电泳液中)7) 电泳缓冲液 （0.5TBE）的组成及其离子强度影响 DNA 的迁移率，无离子存在时，3核酸
13、基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致 DNA 变性，一般采用1TAE， 1TBE，1TPE（均含 EDTA pH8.0） 。2溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。3电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。实验三 外源 DNA 片段在质粒载体中的克隆DNA 重组技术包括载体及外源 DNA 片段的酶切消化、目的片段的获得及纯化、目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定等内容。DNA 片段
14、的克隆技术是分子操作的核心部分。实验目的：学习 DNA 的酶切、纯化及外源片段与载体的连接，将 BAC 克隆所携带的外源DNA 酶切片段亚克隆到 pUC18 载体上。实验材料：外源片段来自一个含有水稻 DNA 片段的 BAC 克隆的酶切片段；克隆载体为PUC18。实验原理：限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末端或平端的外源片段，经DNA 的纯化处理后用于连接反应；选择克隆载体 pUC18 多克隆位点上相应的限制性内切酶切割，并用碱性磷酸酶处理防止载体自连；在连接酶的作用下将外源片段连接到载体上，实现外源片段的克隆。实验步骤：1 载体 pUC18 和外源 DNA 片段的限制性酶切
15、：l 反应体系，用 1.5ml tube，冰上操作）： （50 DNA 30 llR.E 1 l10buffer 5 ddH2O 14 lll 外源片段酶切产物和 5 37反应 1hr，分别取 8 PUC18 酶切产物于 1.0%凝胶检测酶切是否完全；按 25 步纯化、回收 DNAl2 加入 ddH2O 150 （扩大体积） ，加入等体积氯仿/ 异戊醇（24:1） ，颠倒混匀，12000g 离心 10 min；3 吸取上清，加 1/10 体积 3M NaAc 和两倍体积无水乙醇，-20放置 15 分钟以上；4 12000g 4冷冻离心 15 分钟；5 l ddH2O（1.5mll ddH2O（
16、0.5ml tube 中） ，PUC18 溶于 20 倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后外源 DNA 溶于 10 tube 中） ；6 按以下反应去除载体 PUC18 的 5磷酸基团，50反应 30 min 以上DNA 20 llCIAP（TaKaRa） 0.5 l buffer 4.0 10 ddH2O l 15.5 7 70水浴 10 min, 使 CIAP 失活；l8 按 25 步纯化载体，溶于 10 ddH2O；l 体系）： 9 连接反应（15 lDNA 10 pUC18 l 2.5 l buffer 1.5 5 ll) 1 T4 ligase (3U/16水浴过夜10 转化大肠杆菌
17、感受态细胞11 转化子的鉴定附注：1. 根据试验目的和外源片段的不同可选用不同的载体，采用不同粘性末端的双酶切可实现外源片段的定向克隆。2. 克隆中用到的几种工具酶：（1）限制性内切酶gl 反应体系中，37下，经过 1 小时的反应将 1限制性内切酶的一个活性单位（1U）：指在 50 DNA 完全切割所需要的酶量。限制性内切酶的 star 活性：限制酶在某些条件下使用时对 DNA 切割的位点特异性可能降低，即可以切割与原来识别的特定 DNA 序列不同的碱基序列，这种现象叫限制酶的 star 活性。它的出现与限制酶、底物 DNA 以及反应条件有关。（2）碱性磷酸酶细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱
18、性磷酸酶（CIAP ）都能催化水解 DNA、RNA、dNTP和 NTP 上的 5磷酸残基。比较而言，CIAP 更常用，因其可在 70 10内加热灭活或通4过苯酚抽提而变性失活，同时 CIAP 的活性比 BAP 的高 1020 倍。它主要用于：（1）克隆时去除载体的 5-P，以防载体自连；（2）在用 Kinase 进行 5末端标记前，去除 DNA的 5-P。（3）连接酶体外催化磷酸二酯键的形成可使用两种酶：大肠杆菌连接酶和 T4 噬菌体连接酶，但几乎在所有的克隆中 T4 噬菌体连接酶都是首选的酶，因其能在正常的反应条件下能有效的将平端连接起来。3. 氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它
19、是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。实验四 感受态细胞的制备体外连接的 DNA 重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA 的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和 CaCl2 法将外源 DNA 导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和 CaCl2 感受态细胞。实验目的：学习感受态细胞的制备过程或 DH10B实验材料：大肠杆菌菌株 DH5实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞
20、上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为 1091010 转化子/礸 DNA；对于热激法，是利用冰冷的 CaCl2 处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态” ，易于摄取外源 DNA。转化效率为 106 107 转化子/ 礸 DNA。CaCl2 感受态细胞的制备实验步骤1 或 DH10B） ，挑取单菌落于 LB 培养基中 37摇床培养过夜（约 16 小时） ； 前夜接种受体菌（DH52 取 1ml 过夜培养物转接于 100ml LB 培养基中，在 37摇床上剧烈振荡培养约 2.5-3 小时（250-300rpm）
21、；3 将 0.1M CaCl2 溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4 吸取 1.5ml 培养好的菌液至 1.5ml 离心管中，在冰上冷却 10 分钟；5 4下 3000 g 冷冻离心 5 分钟；l 预冷 0.1M6 弃去上清，加入 100 CaCl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置 20 分钟；7 4下 3000 g 冷冻离心 5 分钟；8 l 预冷 0.1M CaCl2 溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 弃去上清，加入 1009 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（70） 。电转
22、化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1. 或 DH10B） ，挑取单菌落于 LB 培养基中 3 前夜接种受体菌（DH57摇床培养过夜；2. 取 2ml 过夜培养物转接于 200ml LB 培养基中，在 37摇床上剧烈振荡培养至OD6000.6 （约 2.5-3 小时） ；3. 将菌液迅速置于冰上。以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4. 吸取 1.5ml 培养好的菌液至 1.5ml 离心管中，在冰上冷却 10 分钟；5. 4下 3000g 冷冻离心 5 分钟；l 冰冷的 10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；6. 弃去上清，加入15007. 4下 3000g 冷冻离心 5 分钟l
23、 冰冷的 10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；8. 弃去上清，加入7509. 4下 3000g 冷冻离心 5 分钟l 冰冷 10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；10. 加入 2011. 立即使用或迅速置于-70 篊超低温保存。附注：影响感受态细胞转化效率的因素及实际操作过程中应注意的事项：1) 菌株 OD600 为 0.5 时细胞密度是 5107/ml） ； 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测 OD600 来控制。DH52) 所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3) 经 CaCl2 处理的细胞，在低温
24、条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的） ；4) 化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或Co2+） 、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍） ；55) 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6) 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA；7) 一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；实验五 质粒的转化及转化子的鉴定质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导
25、入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞。实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在 0 CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。（2）电
26、转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔 DNA 等大分子进入。同时 DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。热激法转化实验步骤：1 ll X-gal (20mg/ml)，25 l Amp（100mg/ml ） ，250 制备选择性培养基平板：在融化的 250ml LA 培养基中 250 IPTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中；2 取出 3 管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3 每 100 l 感受态细胞加入约 20ng 质粒 DNA，3 管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入
27、任何 DNA（阴性对照） ，用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30 分钟；4 热击：将离心管放置 42水浴，热击 90 秒，注意：勿摇动离心管；5 冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置 12 分钟；6 l SOC 培养基，在 37摇床温和摇动温育 45 分钟，使细菌复苏； 复苏：每管加400 7 布皿：取适当体积均匀涂布于含有 IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的 LA 平板；8 培养：倒置培养皿，于 37培养 1216 小时 即可观察到蓝白相间的菌落（其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子，蓝色菌落是载体自连的转化子）质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤1 ll X-gal (20mg/ml
28、)，25 l Amp（100mg/ml ） ，250 制备选择性培养基平板：在融化的 250ml LA 培养基中 250 IPTG (200mg/ml)，混匀后倒入灭菌培养皿中；2 取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3 l 连接产物，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上； 每管感受态细胞加入 14 电转化仪选择 1800V 作为输出电压；5 将要转化的混合物加入预冷的 1 mm 的电转化杯中，立即按下按纽电击；6 立即加 1ml SOC 培养基到转化杯中重悬细胞；7 将细胞转入合适的培养管中 37 篊培养 1 小时；8 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板；9 37 篊培养过夜，观察结果。
29、附注：1 内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（90mm 平板上不得超过 105 个菌落） ，同时 37培养不应超过 20 小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将2 鉴定转化子中是否含有外源 DNA 片段常用的方法有：互补；1) 2) 杂交筛选；3) 插入失活（一些老质粒如 pBR322 等）;4) 小量提取质粒酶切检测、PCR 检测实验六 PCR 技术聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外核酸扩增系统，是分子克隆技术中的常用技术之一
30、。PCR 具有反应快速、灵敏、操作简便等优点，已广泛应用于分子生物学的各个领域。实验目的：掌握 PCR 原理，学习 PCR 操作过程实验材料：转基因水稻叶片总 DNA，外源基因的特异引物实验原理：PCR 是在模板 DNA、引物和 dNTPs 的存在下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应。PCR 技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分为变性、退火、延伸三步，经过6一定的循环，介于两个引物之间的特异 DNA 片段得到大量扩增。实验步骤：1. l； 调整模板浓度至 10 ng/2. 按下列体系配制反应混合液，混匀，加一滴矿物油，离心 5 秒Template DNA l （20 ng） 2 l
31、buffer 2.0 10MgCl2（25mM） 1.5 llPrimer F (10 礛) 0.2 Primer R (10 礛) 0.2 lldNTPs（2mM） 2.0 ll） 0.2 Taq（5U/Add ddH2O to l 20 3PCR 反应循环条件设置：95 3 1 cycle94 1 55 1 72 130“ 35 cycles72 8 1 cycle4 foreverl 溴酚蓝，混匀，短暂离心，取 154检测：加 2 l 反应产物点样电泳；5在 1%的琼脂糖凝胶上点样电泳；EB 染色，紫外观察。附注：1 引物设计应具有特异性，依靠引物设计软件进行引物设计；引物分装成多管，不
32、宜反复冻融多次；2 PCR 反应的各种成份不能遗漏，操作应戴手套，冰上操作；3 根据引物的 Tm 值和扩增片段长度以及 PCR 仪的特性来设定 PCR 循环条件；4 注意分析电泳检测 PCR 产物时出现拖带或非特异性扩增带、无 DNA 带或 DNA 带很弱的可能原因。系列二 Southern 杂交技术Southern 杂交，通过用限制性内切酶消化基因组或其它来源的 DNA，经过琼脂糖凝胶电泳按大小分离酶切所得的片段，随后 DNA 在原位发生变性并从凝胶转移到一固相支持物上（一般是硝酸纤维素膜或尼龙膜） 。DNA 转移至固相支持物的过程中各 DNA 的相对位置保持不变，用一定方法（如放射性同位素
33、）标记的 DNA 探针与固着在膜上的 DNA 杂交，经X-光片自显影显现出与探针 DNA 互补的 DNA 电泳条带的位置。实验一 植物总 DNA 的快速少量抽提（CTAB 法）DNA 分子是分子生物学研究的基本材料，依不同的实验目的可采取不同的抽提方法获取数量和质量不等的 DNA。实验目的： 了解植物 DNA 抽提的主要方法，掌握 CTAB 法快速抽提水稻 DNA。实验材料及试剂：水稻叶片，1.5CTAB，氯仿/异戊醇(24:1)，95% 乙醇或无水乙醇等实验原理：植物 DNA 的抽提常采用两种方法：（1）SDS 法： 离子去污剂，过程长，纯度高；（2）CTAB 法：该方法简便、快速，DNA
34、产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作)。CTAB 是一种非离子去污剂，植物材料在 CTAB 的处理下，结合 65C 水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下 CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用 7075%酒精浸泡可洗脱掉 CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化 DNA，最后经异丙醇或乙醇等 DNA 沉淀剂将 DNA 沉淀分离出来。实
35、验步骤：1. 采集适量幼嫩叶片，用液 N2 研成粉末，0.4 g 装入 1.5ml 离心管中（-20预冷） 。2. 预热 1.5CTAB 到 95，加 1ml 到装有叶片粉末的离心管中，混匀（防止冻融） 。3. 立即置于 65水浴 30min，每 5 分钟，上下颠倒 1 次。4. 12000g 离心 5 分钟。5. 吸取上清液约 600 祃，加入等体积（ 600 祃）氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒数次，至下层液相呈深绿色为止。6. 12000g 离心 5 分钟。7. 取 450 祃上清于一新 1.5ml 离心管，加入 1ml 95%乙醇和 45 祃 10M NH4AC） ，混匀，室温放置
36、10min。8. 12000 g 离心 10min，去上清，用 75% EtOH 浸洗沉淀，自然干燥约 30 min。9. 加入 50 祃 1/10 TE 或无菌水（含 20 礸/RNase） ，置于 4过夜，待 DNA 溶解后，检测 DNA 浓度及质量。注意事项：71尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用 10 mM 的 -ME处理2研钵预冻，粉末至加 CTAB 前不要融化324:1 的氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽了的4所用试剂必需灭菌，手套思考： （1）DNA 降解的可能原因（2）提高 DNA 产量的措施实验二 总 DNA 质量检测及酶切实验目的：了解掌握检测
37、 DNA 质量的方法以及 DNA 定量的方法；了解影响 DNA 在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素；训练 DNA 的琼脂糖凝胶电泳操作及 DNA 的限制性内切酶操作。实验原理：参见系列一中实验二；限制性内切酶的特点：见“基因操作原理 ”。实验材料及试剂：水稻总 DNA 或 BAC 克隆 DNA，琼脂糖，限制性内切酶DraI，EcoRI ，EcoRV，HindIII实验步骤：1取 10 祃 DNA 于 0.8% 凝胶检测；2将 DNA 调节浓度至 300-400 ng/祃 ；2仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书，熟悉反应条件及酶切的贮存浓度（10U-50U/祃）厂家配套试剂；3计算据反应条件所需要的
38、各种试剂准确用量：（0.5 ml tube 中）DNA(3-5 礸) 10 祃buffer reaction 10 1.5 祃Enzyme (15 U/祃) 0.8 祃（冰上）ddH2O 2.7 祃混匀，短暂离心；437 温浴 1-2 hrs (纯 DNA) 或 10 hrs（粗制 DNA） ；5加入上样缓冲液终止酶切反应，也可 65加热 10 min 使酶变性失活；6电泳检测酶切效率：每个样品取 1/10 量用琼脂糖电泳检测，制胶及点样方法同上。结果分析若水稻 DNA 呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则需重做； DNA 被切烂：DNA 降解，重新提 DNA；DNA 切不动：杂质多（多
39、糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等） ，重新纯化；若是 BAC 克隆 DNA，酶切后应出现多条很清晰的不同大小 DNA 带。思考：什么是酶星活性？如何避免？影响酶切效率的因素？EB 指示剂原理？实验三 电泳、转膜转膜是把 DNA 从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物（一般是尼龙膜）上固定，是进行各种后续研究（如 RFLP 分析，阳性克隆的筛选验证等所有涉及分子杂交的研究）的前提。实验目的：掌握 Southern blotting 的原理及操作步骤实验原理：1. 转膜的方式：向上的毛细管转移向下的毛细管转移同时向两张膜转移电转移真空转移2. 固相支持物的种类及选择：硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失 D
40、NA，9 ，DNA 不能与膜结合。4转膜时间（duration of transfer）约 12 hrs8取决于毛细管系统，DNA 大小，胶厚度(3000Ci/mmol） ，30温育 3 小时以上。3. 杂交将标记好的探针，补加 300 祃杂交液， 100变性（or 0.4N NaOH 变性） ，加入杂交袋（盒）中（忌直接加于膜上） 。杂交前作标记效率测定，25%以上可以往下做杂交， 过夜杂交。杂交效率受杂交速率及杂交稳定性影响。4. 洗膜：从低严谨度到高严谨度冼膜液（具体情况而定）：检测信号强度1SSC/0.1%SDS 洗膜两次（冷 5min，热 65，15min） 依情况可有改动 0.2S
41、SC/0.1%SDS or0.5SSC/0.1%SDS 热冼 65, 15min 0.1SSC/0.1%SDS。5. 包膜：膜从洗膜液中捞出，在滤纸上晾干，膜表面无可见水膜为止（注意：不能太干，以防探针难以洗脱影响再次使用） ，用保鲜膜包膜，压 X-光片，置于-20 或-70 37 天（依据信号强弱掌握曝光时间）6. 冲洗 X-光片在暗室红灯下取出 X-光片，置入显影液中至杂交带显现出来（显影时间依据信号强弱及曝光时间长短可由几秒钟到 2 分钟） ，转入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮（约 10分钟） 。自来水冲洗干净后，晾干，读片。7. 膜上探针洗脱再次使用膜前，必须洗去上次探针！(1
42、) 0.1%SDS，0.1SSC 10min(2) 0.1NaOH，0.2%SDS 2-3min(3) 0.2M Tris.HCL， 0.2%SDS，0.1SSC 20min只洗去探针，而不影响膜上的靶 DNA（因为 DNA 与膜是共价键结合，而 DNA 与探针的结合是氢键结合） 。附注：1. 杂交效率的影响因素a) 杂交温度：双链 DNA 分子，T=Tm-2025 可达最大杂交率，DNA-RNA 杂交分子则低于 Tm 值 10-15。b) 离子强度(1.5M/L NaCl 杂交率最高)c) 双链长度 (形成杂交物长度 ) ：杂交率与双链长度成正比d) 探针的复杂程度 (重复性探针可以增加杂交
43、率 )e) pH5.0-9.0 基本无影响。2. 影响杂交稳定性（影响解链温度的）因素16.6 10单价阳离子，Tm a) 离子强度 在 0.01-0.4M NaCl 之间, 每b) 碱基组成 AT500bp 基本无影响3整个实验过程中应注意的事项：1) 保证转膜质量；2) 操作规范；3) 提高杂交灵敏度（信号强度） ；a) 探针量及标记量（探针变性） ；b) 比活（性）度 =108dpm/u(1000bp）过长，高严谨度下难洗脱非完全配对杂交探针。4放射性同位素：1) 放射性同位素发出的射线主要有：粒子：外照射，一般能量的 粒子穿透能力较弱，射程短，危害性小，稍加防护即可（如手套） ；内照射
44、，电离密度大，危害大。粒子：穿透能力比 粒子强，外照射危害比 粒子大，可引起皮肤的放射损伤。射线：穿透能力很强，外照射时危害性很大，应采取切实有效的防护措施。2) 放射性活度及单位：放射性活度 A 是指一定量的放射性核素在时间间隔 dt 内发生自发核衰变数 dN 与此时间间隔的比值。即 A=dN/dt放射性活度的单位是 Becquerel(贝克勒而) ，简称 Bq。1Bq=1 个衰变/ 秒； 1 居里=3.71010Bq粒子） ，也不表示射线能量的大小。光子，而一个 32P 原子只衰变出一个粒子和一个其不表示放射出射线的多少（如 60Co 一个原子衰变防出 1 个3) 辐射防护的目的:防止发生
45、对健康有害的确定性效应(接受放射性治疗的患者除外), 并将随机性损害效应的发生降低到被认为可以接受的水平，从而保障放射工作人员、公众及其后代的健康与安全，提高放射防护措施的效益，促进放射工作的发展。4) 放射防护的原则：a) 辐射实践的正当化：生产必须，医疗必须，科研教学必须b) 辐射防护的最优化：即综合考虑社会、经济等诸因素之后，使个人剂量的大小、受照人数的多少和不确定发生的照射事件的发生概率可合理达到的低水平。c) 个人剂量限制：为了保证每个人不致受到不合理的危害，必须制定一个个人剂量限制值，放射工作人员的剂量限制：全身均匀照射的年当量剂量限值 H 全身=50mSV; 不均匀照射时，有效剂
46、量 E 不应超过 H 全身。5) 外照射的防护措施：a) 距离防护：人体受到照射的剂量率随着离开电离辐射源的距离的增大而减少。剂量率与距离的平方成反比。b) 时间防护：在剂量率不变时，剂量与时间成正比，即操作时间越短，人员所受到的照射剂量越小。 （ 要求放射性作业应操作熟练、操作步骤应尽量简单易行，尽量减少在辐射场所逗留的时间。 ）c) 屏蔽防护：利用射线通过物质时，与物质相互作用使其能量被物质吸收而逐渐减弱的原理，可以设置一定的屏障物来进行防护。常用的材料有水、砖、大理石、混凝土、重金属铅等。d) 利用衰变：可利用放射性物质存在自发衰变，其活性随之减少的原理进行外照射防护。如：半衰期小于 1
47、5 天的放射性废物，允许放置 10 个半衰期后作一般废物处理。6) 内照射的防护措施防止放射性物质经呼吸道吸入防止放射性物质食入防止放射性物质经体表进入系列三 表达检测11在转录水平上研究和了解基因的表达与调控是分子生物学和基因操作的重要内容。Northern 杂交可以测定总 RNA 或 poly(A)+ RNA 中特定 mRNA 分子的大小和表达丰度，RNA 分子在变性琼脂糖凝胶中电泳，按其分子的大小分开，然后将 RNA 转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，经过体外铰链固定，用放射性同位素标记的 DNA 或 RNA 探针与之杂交，放射自显影后即可以得到待测基因 RNA 表达水平的情况；RT-PCR
48、以 mRNA 反转录生成的cDNA 作为 PCR 的模板进行扩增，比 Northern 杂交更灵敏，对 RNA 的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。实验一 RNA Extraction (mini prep)RNA 的制备与分析对于了解基因在转录水平上的表达与调控和 cDNA 的合成都是必须的，RNA 的纯度和完整性对于 Northern blot，RT-PCR 和 cDNA 文库的构建等分子生物学实验都至关重要。RNA 分离的方法很多，其中最关键的因素是尽量减少 RNA 酶的污染方法一：氯化锂沉淀法实验目的：学习 RNA 的简易制备过程，通过 RNA 电泳带评价 RNA 质量实验材
