1、1第 36讲 基因工程与生物技术的安全性和伦理问题考纲要求 1.基因工程的诞生()。2.基因工程的原理及技术(含 PCR技术)()。3.基因工程的应用()。4.蛋白质工程()。5.转基因生物的安全性()。6.生物武器对人类的威胁()。7.生物技术中的伦理问题()。考点一 基因工程的基本原理和操作技术1.基因工程的概念基因工程也叫 DNA重组技术，它是在分子水平上进行的一种外科手术式的遗传操作，采取类似于工程建设的方式，按照预先设计的蓝图，借助于实验室的技术，将某种生物的基因或基因组提取出来，在生物体外进行加工改造或重新组合，再转移到另一种生物中去，从而定向地改变生物的遗传特性，创造出新型的生物
2、。2.基因工程研究的理论基础(1)分子基础：在 20世纪 40年代证实了 DNA是主要的遗传物质，它是遗传信息的携带者；DNA是生物大分子，基因是 DNA分子上具有遗传功能的 DNA片段。(2)重组基础：在 20世纪 50年代确立了 DNA的双螺旋构型，遵循碱基互补原则，DNA 进行半保留复制，从而解决了基因的自我复制和世代交替问题。(3)转移基础：在 20世纪 60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。3.基因工程操作技术的突破2(1)DNA分子的切割技术限制性内切酶 特 点 ： a.会 识 别 DNA 上 某 种 核 苷 酸 的 序
3、 列 和 位 置 。 b.能 在 这 个 位 置 上 将 DNA 分 子 一 刀两 断 。例子：限制性内切酶 EcoR只能识别 GAATTC序列的位点，并且在 G和 A之间将这段序列切开。黏性末端：被限制性内切酶切开的 DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好是互补配对的。与基因的位置关系：用限制性内切酶可以完整地切下一个或几个基因，正好符合基因工程的要求。存在：主要存在于微生物中。(2)DNA分子的连接技术DNA 连接酶作用：能在两个 DNA片段的末端之间“架起桥梁” ，把它们连接起来。特点：只要在同一种限制性内切酶切割的两种 DNA片段中加上这种 DNA连接酶，它就会把片段
4、缝合得天衣无缝。(3)DNA分子的运载工具条件：第一，运载体必须是一种能够自我复制的较小的 DNA分子，能够比较自由地进出细胞。第二，能使带进去的 DNA在细胞里面进行复制，并且仍然保持原有的特性。第三，作为载体最好具有某些简单的特性，如抗药性、免疫性等。种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。细菌质粒：它是细菌染色体外的一种很小的环状 DNA分子。它不仅能进行自我复制，还带有某种抗性基因，能在细胞之间钻进穿出。镶嵌上一段外来 DNA片段的质粒，就成为一个“杂种质粒” 。杂种质粒进入细胞后，便能出色地完成基因工程师交给它的使命在新的宿主细胞里繁殖并发挥作用，使受体细胞产生相应的表达产物。深化拓展 运载
5、体上标记基因的作用运载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的运载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入运载体的受体细胞，原理如下图所示：31.有关工具酶的判断(1)限制性内切酶只能用于切割目的基因( )(2)切割质粒的限制性内切酶均能特异性地识别 6个核苷酸序列( )(3)DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来( )(4)限制性内切酶也可以识别和切割 RNA( )(5)限制性内切酶、DNA 连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工
6、具酶( )2.有关载体的判断(1)运载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( )(2)每个质粒 DNA分子上至少含一个限制性内切酶识别位点( )(3)质粒是小型环状 DNA分子，是基因工程常用的运载体( )(4)运载体的作用是将携带的目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达( )(5)外源 DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制( )下图中的图 1和图 2分别表示的是 EcoR限制性内切酶和 Sma限制性内切酶的作用示意图，据图分析：(1)请说出 EcoR限制性内切酶和 Sma限制性内切酶识别的碱基序列及切割的位点。提示 EcoR限制性内切酶识别的碱基序列是 GAAT
7、TC，切割位点在 G和 A之间； Sma限制性内切酶识别的碱基序列是 CCCGGG，切割位点在 G和 C之间。(2)以上实例说明限制性内切酶有何特性？提示 说明限制性内切酶具有专一性。命题点一 工具酶的应用分析1.下图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的 A处，则切割基因4时可用的是( )A.Hind B.EcoRC.EcoB D.Pst答案 C解析 A 处有 3处( BamH、 EcoB、 Cla)限制性内切酶的切点，只有使用 EcoB限制性内切酶切割时，才能让目的基因插入到 A处且使原有基因失活。2.用限制性内切酶 EcoR单独切割某普通质粒，可产生 14 kb(1
8、kb即 1 000个碱基对)的长链，而同时用限制性内切酶 EcoR、 Mbo联合切割该质粒，可得到三种长度的 DNA片段，见下图(其中*表示 EcoR限制性内切酶切割后的一个黏性末端)。若用 Mbo限制性内切酶单独切割该普通质粒，则产生的 DNA片段的长度为( )A.2.5和 5.5 B.2.5和 6C.5.5和 8 D.6和 8答案 D解析 依图示可知，该质粒上有 1个 EcoR限制性内切酶的切点、2 个 Mbo限制性内切酶的切点，故用限制性内切酶 Mbo单独切割该质粒时，将产生长度为 6和 8的两种片段。3.(2016全国，40 改编)图(a)中的三个 DNA片段上依次表示出了 EcoR、
9、 BamH和Sau3A三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(运载体上的 EcoR、 Sau3A的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)经 BamH酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_酶切后的产物连接，理5由是_。(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_，不能表达的原因是_。(3)DNA连接酶是将两个 DNA片段连接起来的酶，常见的有_和_，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_。答案 (1) Sau3A 两种酶切割后产生的片
10、段具有相同的黏性末端 (2)甲、丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录 (3) EcoliDNA连接酶 T 4DNA连接酶 T 4DNA连接酶解析 (1)分析图(a)可知，限制性内切酶 Sau3A与 BamH切割 DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用 DNA连接酶进行连接。(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表达。(3)常见的 DNA连接酶有 EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中 T4DNA连接酶既
11、能连接黏性末端又能连接平末端。限制性内切酶的选择方法根据目的基因两端的限制性内切酶切点确定限制性内切酶的种类。(1)应选择切点位于目的基因两端的限制性内切酶，如图甲可选择 Pst。(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制性内切酶，如图甲不能选择 Sma。(3)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制性内切酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 Pst和 EcoR两种限制性内切酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。命题点二 运载体的应用分析4.质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功
12、。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况不同，如图表示外源基因插入位置(插入点有 a、b、c)，请根据表中6提供细菌的生长情况，推测三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )项目 细菌在含氨苄青霉素培养基上生长情况 细菌在含四环素培养基上生长情况 能生长 能生长 能生长 不能生长 不能生长 能生长A.是 c；是 b；是 aB.是 a和 b；是 a；是 bC.是 a和 b；是 b；是 aD.是 c；是 a；是 b答案 A解析 第组中重组后细菌能在含氨苄青霉素和含四环素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏，因此外源基因插入点是 c。第组中重组后细菌能在含氨苄
13、青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因被破坏，因此外源基因插入点是 b。第组重组后细菌不能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏；细菌能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，因此外源基因插入点是 a。5.(2016全国，40) 某一质粒运载体如图所示，外源 DNA插入到 Ampr或 Tetr中会导致相应的基因失活( Ampr表示氨苄青霉素抗性基因， Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒运载体用 BamH酶切后，与用 BamH酶切获得的目的基因混合，加入 DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接
14、转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒运载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒运载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和7仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因
15、工程中，某些噬菌体经改造后可以作为运载体，其 DNA复制所需的原料来自于_。答案 (1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒运载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞解析 (1)质粒作为运载体应具备的基本条件有：能自我复制、具有标记基因、含有一个至多个限制性内切酶切割位点等。(2)由题意可知，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因，所以在含有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒运载体上含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，
16、插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青霉素抗性基因，所以含有质粒运载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，但前者可以在含有四环素的培养基上生长而后者不能，所以可用含有四环素的培养基，筛选出含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。(3)噬菌体属于病毒，病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自于受体细胞。考点二 基因工程的操作过程与应用及蛋白质工程1.基因工程的操作程序(一)目的基因的获得目的基因的含义：是指人们所需要的进行研究的基因，如抗虫基因、抗病基因等。(1)化学合成法含义：是指利用化学反应直接合成基因。适用范围：主要适用于已知核苷酸序列的、相对分子质量
17、较小的目的基因的制备。(2)从基因组中直接分离法“鸟枪法”分离基因的主要步骤a.提取基因组的 DNA，然后进行“散弹射击” ， 即用限制性内切酶或其他机械方法将完整的双链 DNA分子随机切割成适当长度的片段。b.把上述片段连接到合适的运载体上，通过运载体分别转入不同的受体细胞中，使外源 DNA随着运载体的复制而复制，从而进行目的基因的增殖。c.采取合适的方法，对含有外源 DNA片段的受体细胞进行检测，找出目的基因所在的运载体。8由于真核生物基因组较大，分离目的基因时，往往要根据已获得的信息，采用很多综合的分子生物学技术。例如：利用 DNA扩增仪(PCR 仪)直接扩增目的基因；也可以利用反转录法
18、，合成双链 DNA，从而获得所需要的目的基因。(二)基因表达载体的构建(1)方法用同一种限制性内切酶去切割质粒和目的基因。在 DNA连接酶的作用下，有切口的质粒就会与同样末端的目的基因连接在一起。(2)结果：形成一个含有目的基因的新环状质粒 DNA分子表达载体。(3)原因：把目的基因包装一下，就很容易逃过受体细胞的防御系统，免遭“灭顶之灾” 。(三)目的基因的导入根据受体和运载体的类型不同，所采取的导入方法也往往不一样。目前经常使用的目的基因导入方法有：(1)花粉管通道法含义：指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。导入外源基因有
19、如下两种方法：柱头滴加法、花粉粒携带法。优点：基本上适用于任何开花植物，并且操作简便。缺点：工作效率较低，且后代的遗传情况较复杂。(2)氯化钙法运载体与受体细胞：运载体是质粒，受体细胞是大肠杆菌。原理：受体细胞经过一定浓度的氯化钙处理后，细胞膜的通透性会发生变化，可以允许含有目的基因的运载体分子进入感受态细胞。优点：这一方法也是扩增表达载体的常用方法，在很短的时间内，就可以获得大量的目的基因及目的基因的表达产物。(3)农杆菌介导的遗传转化法农杆菌：是一种土壤细菌，它侵染植物细胞后，会使植物组织形成肿瘤。介导的原理：a.质粒上的一段 DNA能够从一个细胞转移到另一个细胞，这段 DNA被称为转化
20、DNA(T-DNA)，它包含有生长素基因和细胞分裂素基因，而且可以插入植物基因组，引起植物细胞的变化。b.由于 T-DNA转移频率很高，而且 Ti质粒上可插入几百至几千个碱基大小的 DNA片段，因此可以利用这种天然的遗传转化体系，将目的基因转移到植物细胞。优点：转化频率高、成本低、操作简单，而且转基因后代的遗传组成比较容易分析。(4)基因枪法9原理：将连接到运载体上的目的基因的 DNA溶液与金粉或钨粉共同保温，使 DNA吸附于金属颗粒表面，然后，在一个真空的小室中，利用高压放电将带有基因的金粉或钨粉轰击进入受体，实现转基因的目的。(四)目的基因的检测与表达产物的测定(1)形态检测如果目的基因的
21、表达产物具有明显的表型性状，可以根据目标性状的有无来判断目的基因是否表达。如果目的基因的表达产物没有明显的表型，可以通过报告基因的表达情况来检测目的基因的表达。(2)分子检测PCR 检测a.含义：根据目的基因的序列设计引物，采用 PCR技术对目的基因进行扩增，如果能扩增出目的基因片段，说明目的基因已整合到受体细胞中。b.实例：对除草剂基因的检测，就可以根据除草剂基因的序列设计引物，然后提取受体细胞的基因组 DNA，进行 PCR扩增，根据电泳扩增条带的有无，判断目的基因是否整合到受体生物基因组中。分子杂交检测a.方法：把目的基因片段进行放射性同位素标记或进行生物素荧光标记，用标记好的基因片段作探
22、针，与受体生物的基因组 DNA进行杂交。b.结果预测：如果有杂交斑点，说明目的基因已经被导入受体细胞内，反之，则说明目的基因没有进入受体细胞中。2.基因工程的应用及产业化前景(一)植物基因工程成果(1)突破了传统杂交育种的局限性转基因技术的应用：科学家发现，在一些野生品种和非栽培品种中，存在着很多优质、抗逆的性状，但是不同物种之间存在着天然的生殖障碍，远缘杂交不育。转基因技术可以实现不同物种之间的基因转移，克服这一障碍。实例：科学家利用转基因技术，把抗病毒基因引入烟草和马铃薯，培育出了抗病毒的烟草和马铃薯。转基因技术优点：通过转基因技术大大扩展了可利用基因的种类，克服了远源种及种间杂交不育或不
23、能杂交的障碍，使得生物界存在的抗病虫害基因、优良的品质基因等都可以重组到植物染色体上，并使之在植物体内遗传和表达，从而培育出优良的品种，同时还缩短了育种周期，为农业生产带来广阔前景。(2)开辟了生产疫苗的新途径10科学家培育出一种可以生产乙肝疫苗的转基因胡萝卜，通过生吃或者榨汁食用，就可以达到接种疫苗的效果，简便易行。但该方法还需进一步试验来验证疫苗的疗效及安全性。(二)动物基因工程成果(1)改良畜禽经济性状的新思路新思路：通过转基因技术，可使受体动物合成某些必需的氨基酸， 或改变动物的生长调节系统，进而促进动物生长、提高饲料的利用效率等。实例：1985 年，科学家第一次将人的生长激素基因导入
24、猪的受精卵获得成功，转基因猪与同窝非转基因猪比较，生长速度和饲料利用效率显著提高。(2)动物生物反应器为医药事业开辟了新途径目前利用转基因动物生产基因药物，最理想的表达场所是乳腺，因为乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响到转基因动物本身的生理代谢反应。(三)基因治疗(1)基因治疗的基本原理含义：是将健康和正常的基因通过某种运载体导入人体细胞中有缺损或有变异基因的部位，并使目的基因在有机体内有效表达，达到防治疾病的目的。治疗策略及程序主要包括目的基因的选择和制备、运载体的选择，靶细胞的选择、目的基因进入靶细胞的方式及外源基因表达的检测。(2)基因治疗的成绩及展望基因治疗的概念在不断
25、扩展，不再局限于用正常基因替换体内的异常基因，还可以导入人体内没有的基因，对人体的生理代谢进行调节。3.蛋白质工程的诞生(1)蛋白质工程的含义：根据蛋白质的精细结构与生物活性以及结构与功能之间的相互关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。(2)改造和设计蛋白质的方法：一种是多肽合成法，即利用多肽合成仪，从组成蛋白质的第一个氨基酸合成起，合成一种全新的蛋白质；另一种是采用基因工程手段，对负责编码某种蛋白质的基因进行设计，合成出更符合人们要求的蛋白质。4.蛋白质工程的研究与应用(1)蛋白质工程的研究主要包括以下几个方面：通过基因工程技术分析蛋白质的 DNA编码序列，对蛋白质进行分离纯化，测定蛋白质的序列并对其结构与功能进行分析，通过计算机辅助设计突变区，对编码蛋白质的 DNA进行定点突变改造等。(2)应用在工业上的应用：人们运用蛋白质工程技术来改造天然生物酶，使其能够适应特殊的工业
