1、1第 37 讲 微生物技术考纲要求 1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。4.利用微生物进行发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用。考点一 培养基对微生物的选择作用及微生物的纯培养一、培养基的制备1.培养基的配制和灭菌(1)实验原理培养基a.含义：人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定和保存各种微生物。b.成分：一般包括水分、碳源、氮源、微量元素和无机盐等。选择培养基a.选择依据：不同种类微生物的生长繁殖对营养的要求不同。b.选择途径：人为控制培养基的 pH、碳源、氮源、渗透压等条件。c.选择结果：使选择的培
2、养基利于某类或某种微生物的生长，而不利于其他微生物的生存，可以达到分离、培养不同微生物的目的。灭菌a.灭菌原因：及时杀灭培养基中的微生物，同时防止微生物大量繁殖造成的培养基营养成分的改变。b.常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌。(2)方法步骤2培养基的制作流程为：称量溶化调 pH分装加塞和包扎灭菌摆斜面及倒平板。2.培养基的种类培养基按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。二、培养基对微生物的选择作用1.探究不同培养基中生长的优势菌群探究程序：问题作出假设设计实验实施实验得出结论表达交流。2.菌落(1)含义：将微生物通过某种方法接种到适于生长的固体培养基表面上，在适宜的温度下培养一段时间后，单个的菌
3、体或孢子生长繁殖成的一个个肉眼可见的细胞群体。(2)细菌与酵母菌的菌落特征细菌菌落的共同特征为：湿润、黏稠、易用接种环挑起，菌落各部位颜色一致。酵母菌菌落外形上与细菌极为相似，但比细菌菌落大而厚，颜色也较单调。霉菌菌落较疏松，常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状，一般比细菌菌落大几倍到几十倍。(3)优势菌群的培养基细菌生长需要的氮源高(C/N 为 41)，pH 中性或微碱性(pH7.27.6)，因此培养细菌常采用牛肉膏蛋白胨培养基。酵母菌和霉菌生长所需的碳源含量高(C/N 为 161)，pH 偏酸性(pH56)，因此分离真菌常采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(简称 PDA)。三、实验：微生物的分离与纯化(一)
4、实验原理1.分离的依据：微生物的分离与纯化就是将待检测微生物样品通过划线或涂布接种在固体培养基上，样品中的每一个细胞或孢子都可以生长繁殖形成单个菌落。2.纯化的依据：将单个菌落接种到斜面培养基上，经培养后，即可得到一个微生物的纯种。(二)方法步骤1.微生物的分离(1)稀释：用 1 mL 无菌吸管吸取 1 mL 大肠杆菌培养液，加入到盛有 9 mL 无菌水的大试管中，充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 1 mL 加入另一支盛有 9 mL 无菌水的试管中，混合均匀，依次类推制成 101 、10 2 、10 3 、10 4 、10 5 、10 6 系列稀释度的大肠杆菌稀释液。(2)划线或涂布平板
5、划线分离法：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液一环在平板上划线，常用的划线方法有平行划线和连续划线两种。划线完毕后，盖上培养皿盖，做好标记。涂布分离法：取 3 个平板，底面分别用记号笔写上 104 、10 5 、10 6 三种稀释度，然后用无菌吸管分别吸取相应稀释度的稀释液各 0.1 mL，放入已标记好的平板上，用无菌玻璃3涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置 510 min，使菌液吸附进培养基。(3)培养：将划线或涂布接种的平板倒置于培养箱或温室中 37 培养 1624 h，即可长出单个菌落。2.接斜面分别从培养后长出的单个菌落上挑取少许细胞，接种到斜面培养基上，
6、置培养箱或温室 37 培养 24 h，斜面上菌种长好后，4 保存备用。(1)培养基一般都含有水分、碳源、氮源和无机盐等，有时还需要加入一些特殊的物质( )(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上( )(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害( )(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落( )(5)用涂布分离法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落( )如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请思考：(1)获得图 A 效果和图 B 效果的接种方法分别是什么？提示 获得效果 A 的接种方法为涂布
7、分离法，获得效果 B 的接种方法为平板划线分离法。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？提示 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？提示 火焰附近存在着无菌区域。命题点一 培养基及其制备方法分析1.(2018天津一中调研)下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是( )成分 蛋白胨 葡萄糖 K2HPO4 伊红 美蓝 蒸馏水含量 10 g 10 g 2 g 0.4 g 0.065 g 1 000
8、 mL4A.从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基B.该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨C.该培养基缺少提供生长因子的物质D.该培养基调节合适的 pH 后就可以接种使用答案 B解析 分析表中成分可知，该培养基中没有凝固剂，为液体培养基，该培养基的营养成分齐全，但存在伊红、美蓝等鉴别物质，属于鉴别培养基，A 项错误；该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是碳源，而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源，B 项正确；该培养基中存在的无机盐和蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子，C 项错误；培养基调节完 pH 还要进行灭菌等操作后才能使用，D 项错误。
9、2.(2017济宁模拟)高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选出了能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示。请据图回答：(1)号培养基从物理状态来看，属于固体培养基，配制时要加入 作为凝固剂，从用途来看属于选择培养基，应以 作为唯一碳源。(2)配制固体培养基的基本步骤是( )A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板(3)溶化时，烧杯中加入琼脂后要不停地 ，防止琼脂糊底引起烧杯破裂。对培养基灭菌的方法一般为 。(4)过程是 ，过程所使用的接种方法是 法。(5)部分嗜热
10、菌在号培养基上生长时可释放 分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，挑选相应的菌落，接种到号培养基进一步分离纯化后，再对菌种进行 培养。答案 ( 1)琼 脂 淀 粉 (2)C (3)搅 拌 高 压 蒸 汽 灭 菌 (4)稀 释 涂 布 分 离 (5)淀 粉 酶 扩大5解析 固体培养基通常加入琼脂作为凝固剂。本实验的目的是获得产生高温淀粉酶的嗜热菌，故其选择培养基中应以淀粉作为唯一碳源。配制固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。配制培养基加热溶化时，要注意加入琼脂后需不断搅拌，防止琼脂糊底和溢出。对培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌。仔细观察题图可知过程，是菌液稀释过程，是采用涂
11、布分离法接种。能产生淀粉酶的部分细菌能分解利用淀粉，其菌落周围会出现透明圈，取这样的菌落再分离纯化可获得相应菌种，以后可以扩大培养用于生产。1.培养基的配制原则(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。(3)pH 要适宜：细菌为 7.27.6，酵母菌和霉菌为 5.06.0，培养不同微生物所需的 pH 不同。2.微生物对主要营养物质的需求特点(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的 CO2，氮源可由含氮无机盐提供。(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源
12、也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。命题点二 大肠杆菌的纯化方法及过程分析3.下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线分离法的操作结果。下列叙述中错误的是( )A.甲中涂布前要将玻璃涂棒灼烧，冷却后才能取菌液B.对于浓度较高的菌液，如甲中的稀释倍数仅为 102，则所得的菌落不一定是由单一的细胞或孢子繁殖而成C.乙培养皿中所得的菌落都符合要求D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端6答案 C解析 灼烧后的玻璃涂棒如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A 正确；稀释倍数过低会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B 正确；平板划线分离法中最后一次划线的末端处形成的菌落
13、才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C 错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体的密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成，D 正确。4.大 肠 杆 菌 是 与 我 们 日 常 生 活 联 系 非 常 密 切 的 细 菌 ， 请 回 答 有 关 检 测 饮 用 水 中 大 肠 杆 菌 的 问题 ：(1)检测饮用水中大肠杆菌的含量时，通常将样品进行一系列的梯度稀释，将不同稀释度的水样用玻璃涂棒分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，然后记录菌落数量，这种方法称为 。判断下面所示的 4 个菌落分布图中，不可能是
14、用该方法得到的是 。(2)用上述方法统计样本中菌落数时是否需要设置对照组？ (填“需要”或“不需要”)，其原因是需要判断培养基 ，对于固体培养基应采用的检测方法是将 的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行 (填“消毒”或“灭菌”)处理；操作者的双手需要进行清洗和 ；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使其内蛋白质变性，还能损伤它的 的结构。(4)检测大肠杆菌实验结束后，使用过的培养基及其培养物必须经过 处理才能丢弃，以防止培养物的扩散。答案 (1)涂布分离法 D (2)需要 是否被杂菌污
15、染(灭菌是否合格) 未接种 (3)灭菌 消毒 DNA (4)灭菌解析 D 中菌落分布情况为平板划线分离法所得。为判断培养基灭菌是否合格，本实验需要设置对照。要判断固体培养基是否被污染，可将未接种的培养基在适宜的温度下放置一段时间，若发现有菌落说明培养基已被污染。消毒是指使用较温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。对培养基和培养器皿进行灭菌处理，对操作者的双手需要进行清洗和用酒精消毒。7考点二 微生物的利用一、从土壤中分离有益微生物实验：从土壤中分离纤维素分解菌1.实验原理(1)反应依据：土壤中
16、存在大量纤维素分解菌，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶，分解和利用纤维素和半纤维素。(2)检测依据：因此在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能很好地生长，并产生黄色或棕绿色色素，其他微生物则不能生长。2.方法步骤方法一：(1)制备培养基：依据小辞典，配制依姆歇涅茨基液体培养基。(2)分装：按每试管 5 mL 分装，然后加入 7 cm1 cm 滤纸条，滤纸条紧贴内壁，且一半浸入培养基中，121 灭菌 20 min。(3)制备土壤稀释液：制备 101 、10 2 、10 3 、10 4 、10 5 的土壤稀释液。(4)接种培养：分别吸取各稀释度的土壤稀释液 1 mL 接种到
17、滤纸条上，每个稀释度重复 4 次，置培养箱中 28 培养 14 d。(5)观察：检查各试管中滤纸条上出现的菌落和滤纸颜色变化情况。方法二：(1)制备培养基：制备依姆歇涅茨基培养基平板，在平板上铺一张直径略小于平板的滤纸，用少量上述液体培养基润湿。(2)接种培养：在滤纸上等距放 8 个直径约 10 mm 的土粒，盖上培养皿盖以保持湿度，置恒温培养箱中 2830 培养。(3)观察：每隔 2 d 观察土粒周围滤纸变色情况，直到滤纸颜色变化，长成菌落，于 4 冰箱中保存备用。二、微生物对有机物质的分解1.探究纤维素分解菌是否只能分解纤维素(1)问题：分解纤维素的微生物能否分解其他物质呢？(2)作出假设
18、：假设分解纤维素的微生物还能分解其他物质，包括淀粉、木质素、果胶等大分子含碳有机物。(3)设计实验：分组设计实验方案，用同一种分解纤维素的微生物分解不同的其他物质(淀粉、果胶和木质素等)，或者用不同分解纤维素的微生物分解同一种物质，在实验设计中注意设置对照实验和实验重复等。(4)实施实验：根据实验设计，认真进行实验，记录观察到的实验结果。8(5)得出结论：根据实验过程分析实验结果，得出结论。(6)表达交流。2.分解纤维素的微生物的意义与作用(1)在自然界碳素循环中具有重要意义。(2)微生物的种类繁多、分布广、数量大，而且所起的作用也多种多样。三、利用微生物制作食品实验：利用微生物制作豆豉1.实
19、验原理(1)豆豉是用煮熟的大豆经过纳豆菌发酵制成的。纳豆菌分泌的蛋白酶能够分解大豆中的蛋白质，产生小分子多肽及多种氨基酸，制成风味独特的发酵食品。(2)在制备过程中，根据纳豆菌的芽孢对热不敏感的特性，可采用高温控制杂菌污染。2.方法步骤(1)制 备 豆 豉 菌 悬 液 ： 在 锥 形 瓶 中 倒 入 30 40 mL 开 水 ， 加 入 新 鲜 的 豆 豉 5 6 粒 ， 摇 匀 ，备 用 。(2)浸泡：将黄豆装入杯中加水浸泡 15 h 左右。(3)煮豆：将浸泡过的黄豆煮 2030 min，直到黄豆用手轻轻一掐就破即可。(4)接种：在容器内铺上一块双层纱布，将煮好的黄豆趁热捞入容器内，将豆豉菌
20、悬液洒在豆子表面，用消过毒的玻璃棒快速搅拌均匀。(5)发酵：用另一块双层纱布盖在豆子表面，40 发酵 15 h 左右。当黄豆表面长出一层菌膜时，根据口味加入盐或酱密封保存。(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类( )(2)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( )(3)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( )(4)纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，在纤维素酶的作用下，纤维素可以水解成葡萄糖( )(5)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中，选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度( )(6)制作豆豉要避免杂菌污染，要对原料进行高压蒸汽灭菌( )
21、研究人员在依姆歇涅茨基培养基平板上，筛到了几株有棕绿色色素圈的菌落如图 1 所示，并用筛选到的纤维素酶高产菌株 J1和 J4，在不同的温度和 pH 条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见图 2，请分析：9图 1图 2(1)图中棕绿色色素圈大小代表什么？降解纤维素能力最强的菌株是哪种？提示 棕绿色色素圈大小与纤维素酶的量和活性有关，降解纤维素能力最强的是菌株。(2)结合图 2 推测哪种菌株更适合用于人工瘤胃发酵？提示 J 4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，更适合用于人工瘤胃发酵。命题点一 选择培养基成分及配制方法的分析1.选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理
22、、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为( )A.伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基B.含青霉素的培养基、含氨的无机培养基C.含氨的无机培养基、含青霉素的培养基D.含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基答案 B解析 酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不能抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用土壤中氨氧化成亚硝酸，进而将亚硝酸氧化成硝酸所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。2.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自
23、然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，为土壤样品。请据图回答下列问题：10(1)中培养目的菌株的选择培养基中应加入 作为碳源，中不同浓度碳源的培养基 (填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定中活细菌数量，常采用 法。(2)为对照，微生物在中不生长，在中生长，与培养基的主要区别在于 ；使用 法可以在上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是 。(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？。答案 (1)苯酚 影响 涂布分离 (2)的培养基中没有加入苯酚作为碳源
24、，的培养基中加入了苯酚作为碳源 涂布分离法或平板划线分离 防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基 (3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作解析 (1)选择降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基；苯酚是唯一的碳源，当苯酚消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续繁殖，所以中不同浓度的碳源会影响细菌数量；一般采用涂布分离法来测定中活菌数目。(2)与培养基的主要区别在于的培养基中没有加入苯酚作为碳源，的培养基中加入了苯酚作为碳源；使用涂布分离法或平板划线分离法可以在上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。(3)从制备培养
25、基到接种与培养等全部实验过程要无菌操作：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵：a.实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；c.为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；d.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。选择培养基的制作方法(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生
