1、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010，Vo126，No3 牛骨酶解制备牛肉香精及气质联用分析 郑捷，刘安军，何立蓉，王莹，赵莹 (天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457) 摘要：以牛骨为原料，采用正交实验对复合蛋白酶和风味蛋白酶同步水解牛骨蛋白的工艺45-4g化。再以水解动物蛋白(HAP) 为基料，通过美拉德反应制备牛肉香精。结果表明，牛骨的最适酶解条件是用酶量5000Ug，料液比1：3，酶解温度50，酶解时间 6 h。美拉2-德-“风压的最佳时间为3 h，在不添加香料的条件下最好。采用固相微萃取技术(SPME)并结合气质联
2、用(GCMS)检测技术 对牛骨美拉德反应液进行分析，共鉴定出68种挥发性风味物质。 关键词：牛骨；酶解；美拉德反应；气质联用 文章篇号：16739078(2010)33063l0 Preparation of Beef Flavors by Enzymatic Hydrolyrsis of Beef Bone and Analysis of its Component bylysis OI its omDonent GCMS Ana M ZHENGJie,LIUAn-junHE Li-rong,WANGYmg,ZHAOYmg (CollegeofFoodEngineeringandBiotec
3、hnology,TianjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin300457，China) Abstract：The enzymatic hydrolysis ofbeefbone protein by protamex and flavorzyme were optimized by orthogonal experiment Then the hydrolyzedanimalprotein(HAP)wasusedtopreparethebeefflavorsthroughMaillardreactionThe results showedtha
4、tthebesthydrolysisparameters were enzyme dosage 5000 Ug，subsWate-liquid ratio 1：3，temperature 50，andlime 6 hThetime ofMaillard reactionwithout印 Was3 hThe productsofMaillardreactionofbonewereextractedbySPMEandthenanalyzedbyGC-MSSixty-eightkindsofvolatilecompoundswereidentified Key words：beefbone；enzy
5、matic hydrolysis；Maillard reaction；GC-MS 我国是个畜禽消费大国，但往往只集中于畜禽肉 类的消费，大量的畜禽骨骼却得不到充分利用，既浪 费了这种营养成分丰富且比例合理的资源，又在骨处 理的问题上污染了环境，带来一定的环境压力【1 J。随 着养殖业及畜禽深加工的发展，大量的畜禽骨骼急待 解决。牛骨骼含有多种营养成份，新鲜骨骼中蛋白质 含量占1115，脂肪含量占1012，水分含量 占55-65，同时还含有粘多糖、钙、磷、维生素等 多种营养素。蛋白质中以胶原蛋白为主，约占总蛋白 质量的7080，含有人体所需的l9种氨基酸LZJ。 而近年来，以动物蛋白为原料，通过
6、酶法水解技术和 美拉德反应制成具有肉类风味的调味基料，是天然调 味品行业的一大发展趋势【jj。因此，以牛骨酶解液为 原料制备肉味香精的研究具有十分重要的意义。 收稿13期：2009-1 1-02 基金项目：天津市科技支撑计划重点项目(编号08ZCKFNC01000)；天津科 技大学科学研究基金(编号20080215) 作者简介：郑捷(1972-)，女，硕士，高级工程师，研究方向：主要从事水 产品及功能性食品的研究和开发工作，主要是风味肉制品的研制与开发。 ， 1材料与方法 11材料与试剂 牛骨；复合蛋白酶(酶活力314x10 Ug)和风 味蛋白酶(酶活力99110 Ug)(购自诺维信天津公 司
7、)；L半胱氨酸、甘氨酸、食盐、葡萄糖、D一木糖、 VB，、水解植物蛋白、洋葱粉、酵母粉、鲜味素、八 角粉等均为食品级；葱、姜、蒜、丁香、花椒、豆蔻 等香辛料均为市售。 12主要仪器设备 LD4-40型离心机(北京医用离心机厂)；HH数 显恒温水浴锅(金坛市金城国盛实验仪器厂)；JB90一D 型搅拌器(上海标本模型厂制造)；YX280B手提式不 锈钢蒸汽消毒器(上海三中医疗器械有限公司)； ESJ2054电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公 司)；320一S型pH计(梅特勒托利多仪器有限公司)； Variam 4000MS气质联用仪(美国瓦里安技术有限公 司)。 13实验方法 131牛骨酶解工艺
8、 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010，Vo126，No3 新鲜碎牛骨一高压蒸煮一酶解一灭酶一离心一过滤一收 集上清液 牛骨细碎后经高压蒸煮40 min，蒸煮完毕后按一 定的料液比加水，加入等量蛋白酶后在恒温水浴下水 解，并定期搅拌，反应结束后沸水灭酶10 min，水解 液于3000 rmin转速下离心弃去固形物，除去上层脂 肪，过滤收集上清液备用。 132美拉德反应制备牛肉香精 真空浓缩酶解液至固形物含量为20。在浓缩的 酶解牛骨液中，准确称量并添加3半胱氨酸(以浓缩 酶解液的质量计，下同)；9甘氨酸；6木糖：20葡 萄糖；45VB ；
9、50水解植物蛋白；40洋葱粉； 10酵母粉；10盐；01鲜味素；005八角粉。搅 拌均匀后，将不加香料的酶解液密封分装为1、2、3、 4号样，加香料的酶解液密封分装为5、6、7、8号样， 置于密封的耐压瓶于不锈钢蒸汽消毒器进行热反应。2 h后取出l、5号样，其余继续进行热反应，3 h后取 出2、6号样，其余继续进行热反应，4 h后取出3、7 号样，5 h取出4、8号样。 133水解度的测定 采用甲醛滴定法 】和凯氏定氮法【6测定水解液中 游离氨基态氮含量和原料总氮含量，再按下式计算水 解度： 水解度(DH)=水解液中游离氨基态氮含量 原料总氮量 13-4感官分析方法 情感检验法，或者叫接受性检
10、验法p】。将每组样 品稀释至同一体积分数，样品按顺序进行编号，品评 人只需按照喜好程度打分，评分等级为010分，l0 分最好，0分最差，评价指标包括色泽、咸味、回味、 香味、焦味五项。感官评定具体标准如表1。 表1感官评定标准 Table 1 Sensory evaluation standard 类别 108 7-5 43 2-0 色泽 深褐色 浅褐色 过 过浅 黑色深黄色 成味 适宜 稍重淡 较重淡 重无盐味 回味 悠长 较长 短 无回味 香味 酱香浓郁较测太浓 很淡 无香味 焦味 无焦味 很淡 有焦味 很浓 总分=色泽+成味+回味+香味+焦味 135固相微萃取法(SPME) 在样品瓶中装
11、入自制牛骨香精约15，将顶空瓶 置于46恒温条件下放入水浴中平衡30 min；将己 老化好的SPME针头插入样品中，用手柄将石英纤维 307 头推出暴露到顶空的气体中萃取；萃取30 min后，用 手柄使纤维头推回到针头内；拔出针头将吸附了分析 组分的萃取头插入GCMS进样器中，使待测组份解 析，进入GCMS进行分离和分析。 136气相色谱条件 柱子型号：vF5ms，30 mx025 mmx025 grn；柱 温：初始温度40，保持4min后以5min升至终 温240并保持5 min；进样口温度：250；分流比： 5；柱流速：10 mLmin；载气：He(99999)。 l_37质谱条件 扫描范
12、围：采集的质量范围501000；传输温度： 280；离子阱温度：220。 138挥发性化合物的鉴定 根据GCMS分析对挥发性化合物进行鉴定，把 分离的化合物的质谱数据与经计算机检索标准谱图库 相匹配。 2结果与讨论 21 牛骨酶解工艺条件的优化 211酶用量对水解度的影响 图1酶用量对水解度的影响 Fig1 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis 图1为保持其他条件不变，不同加酶量下蛋白酶 酶解牛骨的效果。由图可知，随着酶用量的增加，其 水解度逐渐上升。当酶用量增加到4000 Ug后，水解 度增加缓慢，考虑到经济效益，选择酶用量为4000
13、 Ug 适宜，此时牛骨水解度为1388。 212料液比对水解度的影响 保持其他条件不变，不同料液比下蛋白酶酶解牛 骨的效果见图2。 由图2可知，牛骨水解度随着料液比的升高呈现 先增加后降低的趋势。料液比为1：4时，其水解度达 到最大，为1254。因此选择料液比1：4适宜。 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010，Vo126，No3 芒 * 图2料液比对时I司的影响 Fig2 Effect of the RTW on degree of hydrolysis 21_3酶解温度对水解度的影响 在蛋白质酶解过程中，温度从蛋白酶催化反应速 度和蛋白
14、酶的稳定性两个方面直接影响酶解反应的效 率。在一定范围内，酶解效率随着温度升高相应提高。 当温度过高时，酶稳定性随着酶蛋白变性而下降，酶 解效率随之降低。保持其他条件不变，不同酶解温度 下蛋白酶酶解牛骨的效果见图3。 芒 图3酶解温度对水解度的影响 Fig3 Effect of temperature on degree of hydrolysis 由图3可知，牛骨水解度随着温度的升高呈现先 增加后降低的趋势。温度50时，其水解度达到最大， 为1473。因此选择酶解温度为50适宜。 214酶解时间对水解度的影响 l7 16 l 5 14 童 3 12 ， 图4酶解时间对水解度的影响 Fig4
15、Effect oftime on degree ofhydrolysis 保持其他条件不变，不同酶解时间下蛋白酶酶解 牛骨的效果见图4。随着水解时间的延长，水解度增 加。在牛骨酶解5 h后，其水解度增加较为缓慢。因 此选择酶解时间为5h适宜。 215酶解条件的优化 根据单因素实验的结论，选择酶用量、料液比、 酶解温度和时间设计四因素三水平正交试验，其因素 水平设计见表2，实验结果见表3。 表2正交实验因素水平表 Table 2 The factors and levels of orthogonal test 由表3可知，4种因素对水解度影响大小顺序为： 酶用量酶解时间酶解温度料液比。牛骨酶解
16、的 最优组合为A3B3C2D3，因而确定最佳工艺条件为酶用 量5000 Ug，料液比13，酶解温度50，酶解时间 6 h。 22牛骨香精制备工艺 221 反应时间对风味的影响 相同的反应温度下，不同反应时间得到的产物有 差距，时间过短，反应不完全，时间过长，产生过多 的杂味物质。本实验选择了2h、3h、4h、5h的条件 下进行热反应，反应温度121，应用感官评价的方 法进行评定，结果如图5、图6。 308 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010，Vo126，No3 4305 ； 蠢2。0 g篓 0 及应时问h 图6加香料条件下反应时间对风昧
17、的影响 Fig6 Effect of reaction time on the flavor with spice 由图可知，无论是加香料的还是不加香料的牛骨 酶解液，经过长时间的美拉德反应，不但不能使风味 变得更加浓郁，反而会产生明显的焦糊味降低香精品 质。 222香料对风味的影响 也 及应时 h 图7香料添加量对风味的影响 Fig7 Effect of spice dosage on the flavor 由图7可知，在相同的时间和温度下，不含香料 的美拉德反应液和加香料的美拉德反应液差异不大， 而且不加香料的LLDI：i香料的稍好一些。 2-3 挥发成分GCMS分析结果 按上述实验条件，
18、对3 h不加香料的牛骨美拉德 反应液(即2号样)经顶空固相微萃取后的挥发性成 分进行了GCMS定性分析，总离子流色谱图见图8。 309 50：l00 lljJl LL lU 2U jU 40 minutes 图8牛骨美拉德反应液GC-MS分析的总离子流图 Fig8 Total ion chromatogram of Maillard reaction product of beef bone by GCMS 通过计算机标准质谱图库检索、各组份的质谱图 分析及与文献报道的质谱数据分析，并通过峰面积归 一化相对百分含量，所得检测结果如表4所示。由表 4可知，共鉴定出68个化合物，主要是酮类、醛类、
19、 酯类、杂环类等化合物。其中，杂环类化合物主要是 呋喃类、吡咯类、噻唑类等。 3结论 通过本实验确定了复合蛋白酶和风味蛋白酶同 步酶解牛骨，并进行美拉德反应制备牛肉香精的最佳 工艺条件为用酶量5000 Ug，料液比(mV)13，酶 解温度50，酶解时间6h。美拉德反应的最佳时间 为3h，在不添加香料的条件下最好。对牛肉香精采用 项空固相微萃取做了GCMS分析，共鉴定出68个化 合物，主要是酮类、醛类、酯类、杂环类等化合物。 参考文献 1】 付文雯，马美湖，蔡朝霞牛骨蛋白酶解制取肽钙的研究进 展J食品与发酵科技，2009，45(1)：15 f2 赵胜年，周兵，耿嘉琦，等酶法水解鲜牛骨骼的研究明食
20、品 科学，1995，(10)：3840 3 刘安军，魏玲娜曹东旭，等美拉德反应制备烧烤型虾味香 精及气质联用分析J现代食品科技2009，25(6)：647680 【4 赵新淮，冯志彪蛋白质水解物水解度的测定J_食品科学， 1994，(1 1)：6567 5 徐英操，刘春红蛋白质水解度测定方法综述J】食品研究 与开发2007，28(7)：1 731 75 6】 马丹凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量【J计量与测试技 术，2008，35(6)：57 58 7 Peter SimkoDetermination ofpolycyclic aromatic hydrocar- bons in smoked meat products and smoke flavouring food additivesJJournal ofChromatography B，2002，770：3-1 8 如 ， 0 O O O luf10U 如 加 m O 丑鸶 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2010，Vo126，No3 310
