1、 SDS 聚丙烯酸胺凝胶电泳一原理SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE ）是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济快速而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。蛋白质在一定浓度的 SDS 中与 SDS 分子按比例结合，SDS 能破坏蛋白质分子间的非共价键，使蛋白质变性并失去原有的空间构型，形成带负电荷的 SDS 一蛋白质复合物。这种复合物由于结合了大量的 SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子，从而降低和消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。这样各种 SDS 一蛋白质复合物在电泳中不同的泳动仅反应了分子量的不同，且蛋白质分子量
2、的对数同其相对迁移率呈直线关系。根据此原理可以制成各种参考蛋白质分子量的对数和它的相对迁移率的标准曲线，从而求得被测蛋白质的分子量。二材料及试剂1Pharmasla 电泳仪 EPS5004002垂直板状电泳装置（BioRAD MiniPROTEAN 11 CELL）3本室常用蛋白质 MARKER。低分子量-97,400kd 66,200kd 43,000kd 31,000kd 20,100kd 14,400kd中分子量-66,000kd 45,000kd 36,000kd 29,000kd 24,000kd 20,100kd 14,200kd430凝胶贮液单体丙烯酰胺 292g双体 N，N-甲
3、叉双丙烯酰胺 08g加双蒸水至 100ml过滤后棕色瓶 4保存5分离胶缓冲液15mol Tris-Hcl PH8.8TrisBase 18.17g加双蒸水 50ml，完全溶解后缓慢加入浓 HCL 至 PH 为 88，加双蒸水定容至100ml6、浓缩胶缓冲液1.0mol TrisHcl PH68TrisBase 12.1g加双蒸水 50ml，完全溶解后缓慢加入浓 HCL 至 PH 为 6.8，加双蒸水定客至100ml7、10%SDS（W V）100ml 室温保存8、10过硫酸铵（WV ）l5ml，4 摄氏度存放（过硫酸铵会缓慢分解，每次配液量不宜多，隔周新鲜配制）9、N，NNN 一四甲基乙二胺（
4、TEMED）10、Tris 一甘氨酸电泳缓冲液5x 储存液：在 900ml 去离子水中溶解Tris-碱 15.1g甘氨酸 94g 72gSDS 5g 用去离子水补至 1000ml11、2X 样品缓冲液（室温储存）0.5M Tris-HCL,Ph6.8 2.0ml冰醋酸 10ml甲醇 20ml去离子水 70ml脱色液冰醋酸：甲醇：去离子水 1：2：7三、操作步骤：l、准备好用于灌胶的玻璃板和间隔片。用去污剂温溶液洗涤玻璃板和间隔片，用自来水彻底冲洗，再用去离子水洗净。用乙醇冲洗玻璃板，并置于一旁晾干。2、组装凝胶模具（可按厂家说明书）装配好灌胶用的模具，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的
5、底部与一个平滑的表面紧密接触，防凝胶渗漏3 、按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液，依次混合水、30丙烯酰胺、1.5M Tris-HCI pH8.8、10%SDS 、10过硫酸铵，一旦加入 TEMED 马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作；4、迅速在两块玻璃板的间隙灌注丙烯酰胺溶液（3.2ml） ，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再 Icm） 。用移液器小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层无水乙醇或去离子水。将凝胶垂直放置于室温下。5、分离胶聚合完全后（30-40 分钟） ，吸出覆盖层液体再用纸条的边缘吸净残留液体。6、配制一定体积一定浓度的浓缩胶溶液，依次混合水、30丙烯酰胺
6、、l.0M Tris-Hcl PH68、10 SDS、10过硫酸铵，一旦加入 TEMED 马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作；7、在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡在加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下；8、当浓缩胶发生聚合时，可把样品置于 lxSDS 凝胶加样缓冲液中，在 100加热 3 分钟以使蛋白质变性（必须将分子量已知的标准参照蛋白质样品同时变性） ；9、浓缩胶聚合完全后（约 30 分钟） ，小心移出梳子，立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。10、把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液；11、按预定顺序加样，每样品加 15ul，最后在所有不用的样品孔中加上等体积的 IXSDS 凝胶加样缓冲液12、将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为 8V/cm当染料前沿进入分离胶后，把电压调为 15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，然后将电压调至零，关闭电源。13、从电泳装置上卸下玻璃板放在纸巾上用垫片撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位14、染色：将凝胶放入平皿中，加入 4-5 倍体积的考马司亮蓝染色液，放在平缓的摇床上于室温染色 4 小时以上。15、脱色：将凝胶放人平皿中，加人 4-5 倍体积的脱色液，置于平缓的摇床上于室温脱色 4-8 小时。期间更换脱色液 3-4 次。直到电泳图谱清晰为止。16、脱色后将凝胶用去离子水冲洗后置于电泳图象分析系统拍照并分析。四、注意事项：1制备凝胶用的玻板用前要保持洁净。2过硫酸铵溶液使用期不宜超过两周。310SDS 室温存放（低温时易析出） 。4丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性，故操作时应带手套。
