1、透射电镜标本制备方法,薄片（1000埃） 1 制备硬标本块儿后超薄切片（最常规） 2 溶液成膜（颗粒1000埃：细胞碎片，病毒，生物大分子） 3 复型薄膜（在组织细胞表面或裂面喷上一层金属膜，将膜剥离后观察）,1制备硬标本块后超薄切片,冰冻块切片：简便，快，结构保存相对差，价格贵 树脂块切片复杂，慢，结构保存较好，价格相对便宜,树脂块的制备,1 取材与固定目的 将所取样本尽可能固定在生活状态下,固定剂,戊二醛（醛基和氨基反应） 四氧化锇（锇与双键螯合） 多聚甲醛（醛基和氨基反应）,醛基和氨基反应,醛醇反应,适合保存：蛋白质，核酸，多糖 不适合保存：脂类 分子量较小，渗透较快,固定效果：戊二醛优
2、于甲醛,适合保存：脂类（蛋白质也可以） 不适合保存：核酸，多糖 分子量较大，渗透能力弱，均匀快速的固定局限于0.25mm(块0.5mm立方) 长时间固定组织块易脆,锇与双键反应,多用双固定：戊二醛+四氧化锇(两步或一步) 块不能太大1mm立方,固定液=固定剂+缓冲液,缓冲液：维持pH, 渗透压 0.1M磷酸缓冲液（PB）,固定剂浓度： 戊二醛（GA）：3%（ 0.1M PB ） 四氧化锇(锇酸):1% （ 0.1M PB ） 多聚甲醛（FA）:4% （ 0.1M PB ） 2.5%戊二醛+2%多聚甲醛（ 0.1M PB ） 1%戊二醛+1%四氧化锇（ 0.08M PB ）,固定方法（迅速）：原
3、位固定 （一些不便于迅速摘取的组织）灌流固定后取材（通过血液循环的途径将固定液引入到要固定的组织中，适用于离体后会变形变性的组织，例如肺泡，对缺氧比较敏感的脑组织等，注意选择最短的循环途径） 取材后固定,小，冷， 快 将动物麻醉或急性处死，暴露所需器官 剪取小块组织，放在预先冷却的固定液中 在洁净纸片上滴一滴冷却的固定液，取出组织块初步修块 （细长条：L：2-3mm,W：1mm） 转移回冷却的固定液中,常规（两步固定法） GA固定液中4C 12h(中间0.5-1h可取出修块) 转移到冲洗液中（0.18M蔗糖in0.1MPB） 4C 12h(原则上与固定时间相等)，中间换液2次 锇酸固定液中4C
4、或 R.T.1h dd水中冲洗 *在冲洗液中可存放12周，但每周至少换一次液（在固定液中长放易脆） *经GA固定后膜还有一定的渗透作用，在经锇酸固定后就没有了 *清洗要充分（GA与锇酸会产生微细沉淀，一般两个固定液间更换两次冲洗液后第三次过夜；锇酸与乙醇会产生微细沉淀）,购买与存储,2 脱水,目的去除样品中的水，为包埋剂（非水溶性）的均匀浸透做准备 脱水剂：乙醇或丙酮（梯度脱水）,*低浓度时对组织有提取作用，时间不可长 *低温可降低提取作用，但100%低温会吸水 *可停在90%过夜，不能在100%，脆 时常摇动 *100%加干燥剂保存在干燥器中,3 浸透与包埋,目的使包埋剂浸透样品后，固化成硬
5、块,包埋剂,（几类物质的混合物） 环氧树脂（基本成分） 氨类物质（催化剂） 酸酐（交联）固化剂 临苯二甲酸二丁酯（增塑剂）,包埋原理,EPON 812,包埋剂的基本要求,*不要加盖 *R.T.下干燥器中可保存相当长时间,4 修块与切片,0.1*0.1mm 90度 梯形,玻璃刀（现做现用，20-30片） 钻石刀 切片机的工作原理：金属膨胀杆 切片厚度与颜色,*环氧,支持网与支持膜,铜网 不锈钢网 3mm 目数 镍网 金网聚乙烯醇缩甲醛膜（Formvar）（0.2-0.5% in 氯仿） 聚乙烯醇缩丁醛膜 火棉胶膜（14in醋酸戊酯） 碳膜*切片保存,5 染色,目的将重金属原子结合到细胞结构上使造
6、成图像反差,重金属：铅盐（Pb,82）蛋白质，糖元，脂类（膜看得清楚）铀盐（U,92） 大多数细胞成分均可，特易于核酸 复染,醋酸铀（黄色有毒晶体，见光分解） 50-70%乙醇饱和溶液，放置过夜，取上清 避光（棕色光口瓶，黑纸罩上） 柠檬酸铅（有毒） 1.33g硝酸铅+1.76柠檬酸钠（2水）in 50ml dd水+浓NaOH数滴 避CO2（水去CO2，口吹， NaOH 颗粒） 醋酸铀30m，漂洗 柠檬酸铅37m（不宜过长），漂洗 0.02N NaOH分色，漂洗 *染液配好后可使用半年左右，放置较久的染液离心一下效果好,半薄切片,对于不均匀的组织重要 厚度0.5微米（介于光与超薄之间）载玻片水滴上70-80 C展开，烤干 相差显微镜观察 经甲苯胺兰（1%）染色后观察，可用无水乙醇分色,2 溶液成膜,对象分散颗粒1000埃：细胞碎片，病毒，生物大分子 适当溶液浓度 悬滴法，喷雾法 负染或投影（增加反差） 磷钨酸钠或钾（12%水溶液）,甲型流感病毒，多形态性（园，椭圆，丝状体），外膜有放射状排列的纤突,3复型薄膜,ER 内质网 M 线粒体,
