1、血 PBMC 标提取方法：样本类别：全：术前血全血样本紫色收集管：抗凝血，收集血浆黄色收集管：促凝血，收集血清抗凝血1. 首先将抗凝管上的病人信息登记至记录本上，住院号、姓名、 （主要针对 HCC 病人） 。2. 抗凝血进行离心，3000rpm,10min.3. 将上清即血浆（OP） ，每管分装 500ul 到 2ml EP 管，标记样本编号（住院号、样品类别），放置-80 度冰箱保存。注意：10ml 抗凝管里留约 0.5ml 上清，避免将血细胞和淋巴细胞吸出，污染血浆（OP） 。4. 往抗凝管中补加 PBS（或生理盐水）至满约 12.5ml，用 3ml 滴管吹打，充分混匀。5. （一管血对应
2、提两管淋巴细胞）取 2 支 15ml 离心管，分别加 3ml 淋巴细胞分离液。6. 向每支离心管中，淋巴细胞分离液层上加步骤 4 中用 PBS（或生理盐水）稀释液并充分混匀后的血样 约 6ml， （这一步操作一定要小心：管壁倾斜，将血沿管壁轻缓加入，保证淋巴分离液和血样的界面清晰，不能将血与淋巴细胞分离液相混） 。7. 室温 25，离心 400g,30min，可见分层。分为四层，最上层为黄色是稀释血浆，接下来是目的层，为白色云雾状淋巴细胞层，接下来是一个白色的粒细胞层，最下面是血细胞。8. 每管小心吸取中间白色云雾状单个核细胞9. 约 1ml，加至 2mlEP 管中。10. 加入等量的 PBS
3、（或生理盐水） ，上下颠倒混匀，离心 1500rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀，获得单个核细胞沉淀，为 OB, 标记样本编号（住院号、样品类别） 。11. 加入 1ml PBS（或生理盐水） ,用枪轻轻吹打混匀，再次离心，1500 rpm，10min，弃上清留下白色的沉淀。12. 加入 200uL PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，均分为两个 EP 管（100Ul/管） ，加入流式抗体 1.5uL，室温避光孵育 30min。13. 如果当天能上机流式：再加入 1ml PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，离心，1500rpm，10min ，弃上清留下白色的沉淀；加入 300uL PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，避光上机 14. 如果当天不能上机：再加入 1ml PBS（或生理盐水）,用枪轻轻吹打混匀，离心，1500rpm，10min ，弃上清留下白色的沉淀；加入 300uL 1%多聚甲醛,用枪轻轻吹打混匀，避光保存（固定） ，第二天上机。
