1、双萤光素酶报告基因的应用,常见载体及案例简介双萤光素酶报告基因检测(Dual-Luciferase Reporter Assay)通常以萤火虫萤光素酶(Firefly luciferase)为报告基因,以海肾萤光素酶(Renilla luciferase)为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势,广泛用于基因调控、非编码 RNA靶向互作等研究领域。Firefly luciferase(简称 F-Luc)以萤光素(luciferin)为底物,在 Mg2+、ATP 和氧分子存在条件下,催化 luciferin氧化成 oxyluciferin,在此过程中发出最强波长在56
2、0nm左右的生物萤光(bioluminescence)。F-Luc 表达框的上游启动子区域插不同功能序列,可以通过转录起始条件造成其报告萤光的变化。在 F-Luc的 3UTR区域插入待验证的靶序列,通过其翻译抑制或 mRNA稳定性降低,可以反映是否存在靶向互作。Renilla luciferase(简称 R-Luc)以腔肠素(coelenterazine)为底物,在氧分子存在的条件下催化 coelenterazine氧化生成 coelenteramide,此过程中发出最强波长在465nm左右的生物萤光。R-Luc 通常由固定组成型启动子驱动,在报告系统中作为校正input误差的内参信号。生物萤
3、光产生反应式 一、应用方向1. 验证 microRNA同 mRNA靶向互作。将待测 mRNA的 3UTR序列插入报告基因载体,再共转入该 microRNA,如果萤光素酶活性下降,则提示为其靶序列。2. 验证 microRNA同 lncRNA靶向互作。将候选的 lncRNA序列插入报告基因载体中 F-Luc的 3UTR区域,检测萤光素活性。3. 启动子结构分析。将启动子区域序列(通常 2k左右)进行分段截短,或对特定位点进行突变,再分别构建入 luciferase报告载体,检测其启动子活性。4. 启动子 SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性,可运用萤光素酶报告系统分析其相对活性。5
4、. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列(通常为启动子区域)插入报告基因载体,同时在实验细胞中共转过表达该转录因子,可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。6. 可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体,在不同上游信号条件下,萤光素酶活性代表了通路的下游响应。例如,在 GPCR研究中,将cAMP response element(CRE)载入报告基因载体,构建稳定表达细胞株后,可以用于分析 GPCR的激活与抑制剂筛选。又如,将 HIF1 的响应原件 hypoxia-responsive element (HRE)插入 luciferase报告载体构建
5、稳转细胞株,可以用于低氧相关通路的研究。二、常用萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic pRL-TK pmirGLO 三、经典案例案例一题目:Long non-coding RNA linc00673 regulatednon-small cell lung cancer proliferation,migration, invasion and epithelialmesenchymal transition by spongingmiR-150-5p期刊:Molecular Cancer小结:验证 linc00673具有 miR-150-5p的靶向结合位点。将 linc00673包括预测
6、结合位点的序列克隆到 pmirGLO- linc00673-WT,同时构建靶位点突变的 pmirGLO- linc00673-MUT,分别共转 miR-150-5p mimics及 NC mimics,结果显示 miR-150-5p转染组的相对荧光值降低,提示存在靶向结合。图:RNA 与质粒共转染 293T,24h 后双萤光素酶检测 案例二题目:SOX9 indirectly regulates CEACAM1 expression and immuneresistance in melanoma cells期刊:Oncotarget小结:验证 SOX9对于 CEACAM1的转录调控作用。分别使用了两种黑色素瘤细胞 526mel和624mel,对 CEACAM1的启动子区域分别选择了 600bp-200bp的截短片段,共转染过表达SOX9,显示 SOX9能够抑制 CEACAM1启动子的转录。图:截短的 pCEACAM1进行双萤光素酶检测