1、LDH 法细胞毒性检测：原理：乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比 ,用比色法测定实验孔LDH 活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率LDH（乳酸脱氢酶）是一种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细胞外； LDH 催化乳酸形成丙酮酸盐，和 INT（四唑盐类）反应转化成红色甲臢化合物，可通过酶标仪进行检测。颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。应用一个 96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒
2、性分析中细胞膜的完整性，这种情况下目标细胞被效应细胞裂解，可判断细胞受损的程度。乳酸脱氢酶（LDH）在胞质内含量非常丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外，此时细胞培养液中 LDH 的活性与细胞的死亡数目呈正比，通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的 LDH 活性进行比较，可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。该实验方法操作简便、快速，可应用于 CTL 和 NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性，目前已有 LDH 法测定 CTL 活性的试剂盒。同时设 4 个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组按 51、101、
3、201（效应细胞靶细胞）细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶操作流程：设立效应细胞孔（不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组）：50l 效应细胞+50l 培养基实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50l 效应细胞+50l 靶细胞设立靶细胞自发释放组：50l 靶细胞+50l 培养基设立靶细胞最大释放组：50l 靶细胞+50l 培养基+10l 裂解液（10）设立体积校正对照组：100l 培养基+10l 裂解液（10）设立背景对照组：100l 培养基250g 离心 4 分钟37孵育 4 小时离心前 45 分钟添加裂解液（10）至靶细胞最大释放组2
4、50g 离心 4 分钟取上清 50l 转移至另一孔板（可选）于独立的孔中加 50l LDH 阳性对照（1：5000）于每孔中添加 50l 再次稀释的底物混合物室温避光孵育 30 分钟添加 50l 终止溶液490nm 测吸收值1. 靶细胞接种数目的优化1.1. 设立检测板1.1.1. 准备靶细胞：调整细胞浓度 0, 5,000, 10,000, 20,000/100l，使用与细胞毒分析相同的培养基及孔板终体积。例如，若以 50l/孔的靶细胞及 50l/孔的效应细胞接种，则以 100l/孔梯度稀释。1.1.2. 设置不含细胞的背景对照组1.1.3. 可选:验证 LDH 阳性对照。使用涡旋混匀器轻轻
5、混匀 LDH 阳性对照液，以 1：5000 稀释（稀释方法：取 2l 原液至 10ml 的 PBS+1%BSA） 。使用与实验孔相同的体积。1.2. 细胞裂解及收获上清1.2.1. 裂解细胞 每 100l 培养基加 10l 裂解溶液（ 10）1.2.2. 37，5%CO2 孵育 45 分钟1.2.3. 250g 离心 4 分钟1.3. LDH 检测1.3.1. 转移 50l 上清至另一孔板1.3.2. 解冻检测缓冲液，取 12ml（避光） ，将剩余的迅速冻存（可以使用 37水浴解冻，但不可放置过长时间） 。将 12ml 检测缓冲液添加到一瓶底物混合液（可用于两个 96 孔板）中，倒置混匀。稀释
6、后，避光、迅速添加。1.3.3. 50l/孔添加稀释的底物混合液，室温避光孵育 30 分钟（未使用的稀释后底物混合物液放于-20保存 6-8 周）1.3.4. 添加 50l 终止溶液1.3.5. 将孔中含有的气泡去除，一小时内检测吸收值（490 或 492nm）1.3.6. 至少检测两次吸收值接种靶细胞（100l/孔）至 96 孔板加入裂解液（或冻存-解冻）250g 离心 4 分钟取上清 50l 转移至另一孔板用检测缓冲液稀释底物混合物添加底物混合物 50l/孔室温避光孵育 30 分钟添加 50l 终止溶液490nm 测吸收值2.细胞毒分析检测2.1. 设立检测板2.1.1. 效应细胞自发释放
7、组 设立不同浓度的效应细胞自发释放组，终体积与实验孔一致2.1.2. 实验组 加入相同数目的靶细胞，按照不同效靶比加入效应细胞，补足培养基（最小体积：100l/孔） 。2.1.3. 靶细胞自发释放组 加入最优化的靶细胞数，补足终体积2.1.4. 靶细胞最大释放组 加入最优化的靶细胞数，补足终体积。2.1.5. 体积校正对照组 100l 培养基中加入 10l 的裂解液，用于校正由于加入裂解液而引起的体积变化（体积改变影响酚红及血清的含量） 。2.1.6. 背景对照组 用于校正培养基中由酚红及血清引起的 LDH 影响。2.1.7. LDH 阳性对照（可选） 使用涡旋混匀器轻轻混匀 LDH 阳性对照
8、液，以 1：5000 稀释（稀释方法：取 2l 原液至 10ml 的 PBS+1%BSA） 。使用与实验孔相同的体积2.1.8. 250g 离心 4 分钟，以使效应细胞与靶细胞充分接触2.2. 细胞培养、收获上清2.2.1. 37，5%CO2 孵育检测板（效靶细胞接触的最短时间为 4 小时）2.2.2. 靶细胞最大释放组中加入裂解液 每 100l 培养基加 10l 裂解溶液（10） 。该体系中Triton X-100 的浓度为 0.8%，可使靶细胞完全裂解（收获上清前 45 分钟加入裂解溶液） 。显微镜下观察细胞状态，若靶细胞未完全裂解，再补 5l 的裂解液。2.2.3. 250g 离心 4
9、分钟2.3. LDH 检测2.3.1. 转移 50l 上清至另一孔板2.3.2. 解冻检测缓冲液，取 12ml（避光） ，将剩余的迅速冻存（可以使用 37水浴解冻，但不可放置过长时间） 。将 12ml 检测缓冲液添加到一瓶底物混合液（可用于两个 96 孔板）中，倒置混匀。稀释后，避光、迅速添加。2.3.3. 50l/孔添加稀释的底物混合液，室温避光孵育 30 分钟（未使用的稀释后底物混合物液放于-20保存 6-8 周）2.3.4. 添加 50l 终止溶液2.3.5. 将孔中含有的气泡去除，一小时内检测吸收值（490 或 492nm）2.4. 结果统计2.4.1. 所有的实验组、效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组的吸收值应减去背景平均吸收值2.4.2. 靶细胞最大释放组的吸收值应减去体积校正对照组的平均吸收值2.4.3. 校正后的值用于杀伤率的统计：细胞杀伤率(%)= （实验组释放 -效应细胞自发释放-靶细胞自发释放）/（靶细胞最大释放-靶细胞自发释放） 100%
