1、第三讲 层析技术,主要内容,一、层析分离的基本概念 二、层析分离的分类 三、层析分离的基本原理 四、层析过程和仪器设备 五、具体应用,一、层析分离的基本概念及其特点,层析分离技术早在二十世纪初就已在生产实践中使用。 1903年，俄国植物学家茨维特(Tswett)在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂，用石油醚作为洗脱剂，他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒入管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内形成了数条相互分离的色带，当时茨维特把这种色带叫作“色谱”（Chromatographie）。 在
2、这一方法中把玻璃管称为“色谱柱”，碳酸钙称为“固定相”，纯净的石油醚称为“流动相” 。因此，层析分离又称色谱分离（Chromatographic Resolution, CR）或色层分离，本讲统一使用层析分离这一名称。,1. 基本概念,一、层析分离的基本概念及其特点,层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分混合物中各组分的物理化学性质的差异，使各组分以不同程度分布在两个相（固定相和流动相）中。 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差异，在固定相和流动相之间经过多次分配（吸附-解吸-再吸附-再解吸）以不同的速率移动，从而达到分离的目的。,1. 基本概念,二、层析分离的分类,1.
3、按分离机理不同分类 吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析2.按固定相形状不同分类 柱层析层析、纸层析层析、薄层层析层析3. 根据流动相的物理形态不同分类 气相层析、液相层析、超临界流体层析4. 根据操作压力不同分类 低压层析分离（0.5MPa） 中压层析分离（0.55MPa） 高压层析分离（550MPa）,三、层析分离的基本原理,（一） 吸附层析 （二）分配层析 （三）凝胶过滤层析,三、层析分离的基本原理 （一）吸附层析,原理：混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。 吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙等。 特点：应用最早，价格较低；选择性低。
4、新型吸附层析技术：离子交换层析、亲和层析、金属鳌合层析、疏水作用层析等。,1. 简介,离子交换层析,利用离子交换剂作为层析支持物（固定相），由于带有不同电荷的蛋白质与固定相间的静电作用力（吸附力）不同，从而达到分离目。,基本原理,离子交换层析,离子交换剂主要由三部分组成载体、官能团及可交换离子。,离子交换剂的种类,按可交换离子带电性不同，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。按官能团不同，可分为强/弱酸性离子交换剂（阳）和强/弱碱性离子交换剂（阴）。常用的载体基质有：纤维素、葡聚糖、琼脂糖及玻璃珠等。,亲和层析,基本原理：利用了生物物质间的特异性相互作用，或者说是利用了某些生物物质之间特异的亲和力
5、进行选择性分离的一种层析分离技术。,亲和层析的基本组成：担体（载体）、目标物和配体、接枝手臂,亲和层析,琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶和硅胶等。 介质商品种类： Sepharose 2B（2%） Sepharose 4B（4%）、 Sepharose 6B（6%） 经过交联而增加机械强度的琼脂糖 Sepharose CL-2B、 Sepharose CL-4B、 Sepharose CL-6B,载体,亲和层析,酶-底物类似物，抑制剂，辅因子； 谷胱甘肽-谷胱甘肽-S-转移酶（GST），GST融合蛋白 抗体-抗原免疫亲和层析 凝集素-多糖，糖蛋白，细胞表面因子受体； 核酸-互补
6、碱基序列，核酸多聚酶，核酸结合蛋白； 三嗪类色素-脱氢酶、激酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶等色素亲和层析 肝素-脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白等 过渡金属离子：可与N, S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基发生亲和结合作用金属螯合层析,配基与目标物,亲和层析,当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。需要在配基与载体连接一个“接枝手臂”，以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子有效的亲和结合。,接枝手臂,金属螯合层析,层析介质中连接有可螯
7、合基团，如：亚氨基二乙酸（ NH2CH2(COOH)2 ，IDA），与某些金属离子络合后，可以吸附某些蛋白质（金属螯合介质能与蛋白质中的组氨酸上的咪唑基及半胱氨酸上的巯基结合） 。 不同蛋白分子形成的配位键的强度各异，从而起到分离纯化作用。,原理,金属螯合层析,Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC) was first used to purify proteins in1975 (Porath et al. 1975) using the chelating ligand iminodiacetic acid (IDA, Figure
8、 4). IDA was charged with metal ions such as Zn2+, Cu2+, or Ni2+, and then used to purify a variety of different proteins and peptides (Sulkowski 1985). IDA has only 3 metal-chelatingsites and cannot tightly bind metal ions. Weak binding leads to ion leaching upon loading with strongly chelating pro
9、teins and peptides or during wash steps. This results in low yields, impure products, and metal-ion contamination of isolated proteins. Nitrilotriacetic acid (NTA) is a tetradentate chelating adsorbent that overcomes these problems.,金属螯合层析树脂的种类,金属螯合层析,NTA occupies four of the six ligand binding site
10、s in the coordination sphere of the nickel ion,leaving two sites free to interact with the 6xHis tag (Figure 5). NTA binds metal ions far more stably than IDA and retains the ions under a wide variety of conditions, especially under stringent wash conditions. The unique,patented NTA matrices can the
11、refore bind 6xHis-tagged proteins more tightly than IDA matrices,allowing the purification of proteins from less than 1% of the total proteinpreparation to more than 95% homogeneity in just one step (Janknecht et al. 1991) The high surface concentration of the NTA ligand is sufficient for the bindin
12、g of approximately 510 mg of 6xHis-taggedprotein per milliliter of resin.,NTA固定金属离子亲和树脂的特点,疏水作用层析,原理：利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。 离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2M或3M NaCl/硫酸铵溶解样品，洗脱时可通过降低盐浓度进行梯度洗脱。 疏水层析介质： 正丁基-Sepharose、 正辛基-Sepharose 苯基-Sepharose,三、层析分离的基本原理 （二）分配层析,原理：其固定相和流动相都是液体，其原理类似于液液萃取，利用
13、混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。其中，固定相是由固定液与载体结合后形成的。 正相层析：固定相为极性，流动相为非极性； 反相层析：固定相为非极性，流动相为极性。分配层析主要用于分离小分子化合物，在蛋白质化学中并不常用。,三、层析分离的基本原理 （三）凝胶过滤层析,原理：根据物质分子大小不同而进行分离的层析技术，又称分子筛层析。由于大分子和小分子在通过层析柱时，所通过得路径不同（大分子进入空隙，小分子进入孔内），流出层析柱的时间不同，从而得到分离。其固定相为凝胶，流动相可根据实验需要选择不同的缓冲溶液。 凝胶过滤层析介质 Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200 Sepharos
14、e-琼脂糖凝胶2B,4B,6B Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400 主要用于脱盐、分级分离和分子量测定等。,四、层析过程和仪器设备,（1）装柱 （2）平衡（equilibrium) （3）上样(loading) （4）洗涤(washing) （5）洗脱(elution) （6）清洗与再生,1. 层析过程,四、层析过程和仪器设备 1. 层析过程,调糊：50% 一次连续加入悬浮液 打开出口阀：层析剂沉降 排除空气 检查均匀度,（1） 装柱,四、层析过程和仪器设备 1. 层析过程,用与样品相同的缓冲液对层析柱进行平衡，直到电导率稳定为止。缓冲液体系包括：缓冲
15、液种类和浓度、pH及盐浓度。,（2）平衡（equilibrium),四、层析过程和仪器设备 1. 层析过程,样品处理： 溶解 选择合适的缓冲液种类 pH 盐浓度 调整样品浓度 过滤：除去不溶物 流速：根据样品浓度与吸附速度而定 上样量：80%交换容量,（3） 上样(loading),四、层析过程和仪器设备 1. 层析过程,采用与上样缓冲液相同的缓冲液体系进行洗涤除去吸附在树脂表面的蛋白。有时可加入适量表面活性剂（0.1-0.5%)；洗涤体积：根据流出液蛋白浓度而定（A2800.05）,（4）洗涤(washing),四、层析过程和仪器设备 1. 层析过程,按操作方式 A.恒定洗脱 (isocra
16、tic elution) B.分步洗脱 (stage elution) C.梯度洗脱 (gradient elution) 按洗脱机理 改变缓冲液盐浓度 改变缓冲液pH 改变缓冲液盐浓度和缓冲液pH 添加剂：表面活性剂、尿素、盐酸胍 洗脱体积：5倍床体积以上,（5）洗脱(elution)离子交换层析,A.恒定洗脱,B.分步洗脱,C. 梯度洗脱,四、层析过程和仪器设备 1. 层析过程,按洗脱机理可分为： （1）竞争性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标物。 例1：GST融合蛋白亲和层析，用还原型谷胱甘肽为洗脱剂；
17、 例2：带有His标签的蛋白质的金属鳌和亲和层析，用咪唑溶液为洗脱剂） （2）非竞争性洗脱：通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类等物化性质降低目标物与亲和介质的吸附能力。 pH洗脱 离子强度洗脱 降低洗脱液极性不会使蛋白变性 促溶性洗脱可使蛋白变性 按洗脱方式可分为： 梯度洗脱 阶段式洗脱,（5）洗脱(elution)亲和层析,pH洗脱 利用BSA-Sepharose 4B 亲和层析柱分离抗BSA血清中不同抗体,四、层析过程和仪器设备 1. 层析过程,2mol/L的盐离子强度 酸：醋酸，盐酸 碱：氨水，氢氧化钠 促溶剂：6-8 M 尿素，6 M盐酸胍 极性溶剂：20% 乙醇 表面活性剂：
18、吐温-80 缓冲液平衡,（6）清洗与再生,四、层析过程和仪器设备 2. 仪器设备,（1）普通,（2）高级,四、层析过程和仪器设备 2. 仪器设备,（1）泵 （2）层析柱 （3）检测器 紫外吸收检测（260nm/280nm/230nm） 电导检测 pH检测 （4）阀门 （5）组分收集器 （6）记录仪,五、具体应用,1. 猪胰蛋白酶的离子交换层析 2. 利用谷胱甘肽-亲和层析树脂纯化GST-融合蛋白 3.带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,五、具体应用 1. 猪胰蛋白酶的离子交换层析,猪胰蛋白酶等电点约为pH10.8 上样缓冲液：0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液 离子交换剂种
19、类：CM-纤维素离子交换树脂 洗涤缓冲液：0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液 洗脱缓冲液： 0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液 0.1 mol/L , pH6.0，柠檬酸钠缓冲液 洗脱方式：分步洗脱 (stage elution),五、具体应用 1. 猪胰蛋白酶的离子交换层析,层析曲线,五、具体应用 1. 猪胰蛋白酶的离子交换层析,纯化表格,五、具体应用 1. 猪胰蛋白酶的离子交换层析,SDS-聚丙烯酰胺电泳检测结果,五、具体应用 2. 利用谷胱甘肽-亲和层析树脂纯化GST-融合蛋白,GST：谷胱甘肽-S-转移酶 谷胱甘肽-亲和层析树脂,Terminal st
20、ructure of Glutathione Sepharose. Glutathione is attached to Sepharose by coupling to the oxirane group using epoxy-activation. The structure of glutathione is complementary to the glutathione S-transferase binding site.,GST结合位点,GST：谷胱甘肽-S-转移酶 谷胱甘肽-亲和层析树脂,GST-融合蛋白的表达和纯化流程,GST,GST-融合表达载体,GST-融合表达质粒的构
21、建过程,GST-融合蛋白的纯化和GST标签的去除,Binding buffer: 1 PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.3) Elution buffer: 50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0,SDS-PAGE检测结果,五、具体应用 3. 带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,五、具体应用 3. 带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,常用的表达载体 外源基因片段克隆到表达载体上 表达方式的鉴定 表达条件的优化 带有HIS-Tag重组
22、蛋白的纯化 纯化结果,五、具体应用 3. 带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,常用的表达载体,pET43.1a载体,五、具体应用 3. 带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,表达质粒的构建,五、具体应用 3. 带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,菌种表达方式鉴定,五、具体应用 3. 带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,表达条件的优化,五、具体应用 3. 带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,Purification,7.4 固定金属离子亲和色谱 三、带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,1 2 3 4 5 M 6 7 8,图9 SDS-PAGE 电泳检测蛋白的纯化 (泳道1
23、：粗蛋白；泳道2，3，4，5分别流穿液收集峰收集样品；M：Marker;泳道6，7，8分别洗脱液收集峰样品),6. 纯化结果,小 结,层析技术,基本概念,分类,按分离机理不同分类 按固定相形状不同分类 按流动相的物理形态不同分类 按操作压力不同分类,基本原理,吸附层析,层析过程,离子交换层析 亲和层析 金属螯合层析 疏水作用层析,分配层析,凝胶过滤层析,应用实例,装柱,仪器设备,平衡,上样,洗涤,洗脱,再生,泵，层析柱，检测器，阀门，自动收集器，数据显示装置,猪胰蛋白酶的离子交换层析 利用谷胱甘肽-亲和层析树脂纯化GST-融合蛋白 带有HIS-Tag重组蛋白的表达和纯化,正相层析 反相层析（色谱）,思考题,综述各种层析技术的基本原理、特点、操作注意事项、具体应用实例及研究新进展。 离子交换层析 亲和层析 疏水作用层析 凝胶过滤层析 反相层析,
