1、组织学技术,一、组织学技术的应用 二、组织学制片技术的分类 三、组织学制片步骤 四、玻璃器皿的清洗 五、盖玻片的清洗 六、载玻片的清洗 七、玻璃器皿洗涤剂配法,一、组织学技术的应用 组织学技术包括、组织学制片技术、胚胎学制片技术、组织化学技术、荧光组化及免疫组化技术、组织培养技术、各种特殊显微技术、电镜组织学技术。组织学技术不但应用于组织学本学科，并且广泛应用于其他多学科，如生物学、解剖学、病理学、肿瘤学、法医学、临床诊断学等。,二、组织学制片技术的分类 组织学制片技术包括普通制片方法和特殊制片方法。制片方法又分为切片法和非切片法两种。切片法分为石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片、等。非切片法分为
2、铺片、涂片、分离片、磨片、整装片、超活体染色等。,三、组织学制片步骤 取材 固定 冲洗 脱水 透明 浸蜡 包埋 修块 切片 贴片 烤片 染色 封片 观察结果,（一）、组织取材 1 动物的处死 有麻醉放血处死法、有直接放血处死法。 （1）吸入麻醉法 、将浸透乙醚的棉花放入玻璃缸内,将动物放入玻璃缸内,盖上玻璃盖， 观察动物麻醉情况，放血处死,此法用于小动物。 （2）注射麻醉法、用3%戊巴比妥钠按每公斤体重12ml静脉注射或腹腔注射，麻醉后,立即放血处死,此法用于大动物。 （3）直接处死法、用金属器械猛击动物的后脑部或直接断头放血处死,此法适合于小动物。 2 动物的选择 动物的选择是组织切片取材的
3、第一步,在组织学中以人的组织为理想，但人的组织不易得到，根据教学的需要,大都以动物的组织来代替。但有些动物的组织器官比人的组织更为典型，如：猪的肝脏、豚鼠胰腺、内耳、猫的肋间肌,显示运动终板，兔的皮下组织和肠系膜作活体染色较为理想 。 （1）猴：神经系统、循环系统、淋巴系统、内分泌系统、泌尿系统、雌雄生殖系统和特殊感官等。 （2）狗：呼吸系统、循环系统、泌尿系统、淋巴系统、内分泌系统、神经系统等。 （3）猫：消化系统、泌尿系统、内分泌系统、神经系统、肌肉组织等。 （4）兔：皮下组织、肠系膜、卵巢、肺、耳壳等。,（5）羊：心脏、膀胱、雌雄生殖系统等。 （6）猪：肝脏、骨髓、脑垂体等。 （7）豚鼠
4、：胰腺、内耳、肾上腺等。 3 取材注意事项： （1）动物放血处死后立即取材，最好在心脏还在跳动时立即取材，马上投入固定液中， （2）切取组织的刀剪必须锋利，切分组织块时，不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压。以免损伤组织。 （3）取材时确定部位和切面的方向。 （4）组织块应力求小而薄,一般长为0.5厘米,宽为0.5厘米厚为0.2厘米, （5）取材应注意清洁，组织块上如有血液、污物和粘液沾着，应用生理盐水洗涤后再入固定液。 （二）固定 1 固定的目的 （1）能迅速阻止死后变化，防止组织的自容与腐败。 （2）使细胞内物质凝固成不溶性物质,如蛋白质、脂肪、酶等。,（3）使组织产生不同的折光率
5、,染色后便于鉴别和观察。 （4）对组织有媒染作用，使不同组织成分对染料有不同的亲和力。 （5）能使组织硬化。 （6）能细胞各部分清晰。 2 固定的方法 （1）小块组织固定、从人体或动物取出组织，切从小块投入固定液中固定。 （2）局部注射固定、某些组织和器官其,固定液不易渗透或渗透较慢，渗透不均匀，还有些器官为保持外型或卷缩，可采取局部注射固定方法，固定46小时后，再将组织切成小块继续投入固定液中固定。 （3）整体注射固定、此法主要用于科研和大体解剖，亦可用于组织学教学制片。 3 固定液 固定液分为单纯固定液和混合固定液两种。 单纯固定液 （1）甲醛、它是一种还原剂，呈酸性,原液浓度为37%40
6、%，配成固定液的浓度,为4%，习惯上称为10%，配制时取甲醛原液10ml，加D.W或缓冲液至100ml,为甲醛固定液。甲醛渗透力强，固定均匀。但脱水后有较大收缩，在某些方法中要求中性甲醛，可在原装瓶内放入碳酸镁使其沉淀为2CM，pH为7.6，也可以加粉笔数根，可长期保持中性。加碳酸钙pH为6.5,固定后，可以直接进入脱水剂脱水，如固定时间较长，需在流水中冲洗2448小时,否则影响染色效果。 （2）酒精、它是一种还愿剂，用于组织,固定以95%的浓度为宜，酒精固定后的组织 细胞核着色不良，一般用于糖元的固定， （3）升汞、有称氯化汞，为剧毒药品，使用时特别注意，它与其它药物混合使用对细胞核和细胞质
7、固定良好。 （4）苦味酸、为黄色结晶，干燥易燃烧、 爆炸，通常加入蒸馏水制作饱和液保存，它的渗透力弱，一般不单独使用，与其它药物混合使用。 （5）冰醋酸、含量为99%，在低温时结成冰状，对染色质固定良好，所以在多种混,合固定中液都用它。 （6）重铬酸钾、水溶液呈弱酸性，它为强氧化剂，不能与酒精等还原剂混合，但与甲醛混合也不能保存过久一般在1224小时失去作用，重铬酸钾固定组织穿透速度快。但必须流水冲洗。 混合固定液、上述某一种单纯固定液不能将组织内的各种成份保存下来，各种药物均有选择性，渗透能力也不同，收缩或膨胀也不相同，因此多配成混合固定液。,（1）Zenker氏液 重铬酸钾 2.5g 升汞
8、(绿化汞） 5g D.W 100ml 此液为Zenker氏保存液 (在临用时取保存液100ml,加冰醋酸5ml即为Zenker氏固定液)。 （在临用时取保存液100ml,加商品甲醛5ml即为Helly氏固定液） 此两种固定液，对细胞质和细胞核固定很好，Helly氏固定液对神经系统固定较好，固定时间24小时，流水冲洗24小时，染色时必须去汞处理。,（2）Susa氏液 升汞(氯化汞） 4.5g 氯化钠 0.5g 三氯醋酸 2g D.W 80ml 冰醋酸 4ml 甲醛 20ml (后两种成份在临用时再加入) 此固定液渗透速度快，对组织收缩小是一种优良的固定液，特别对消化系统、呼吸系统、肌肉组织的固定
9、效果好，固定时,间612小时,固定后不经冲洗,可直入70%酒精脱水,但组织切片染色时必须去汞。 （3）Bouin氏液 苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml 此液为胚胎学与组织学常用固定液，渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为12-24小时,但固定过久,对碱性染料着色不利。,（4）Regaud 氏液 3%重铬酸钾水液 80ml 中性福尔马林 20ml 此液必须现配现用，此液为线粒体、嗜铬细胞和神经胶织细胞的优良固定剂。固定时间2-3天后，再以3%重铬酸钾固定5-7天，固定后流水冲洗。 （5）Carno
10、y氏液 纯酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml,此固定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时间24小时，它是细胞极好的固定液 适合于细胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水。 4 组织固定应注意的问题 （1）所取的组织材料必须新鲜，动物死后在半小时内固定为最好，组织块不能太大。必须在0.5cm长、0.5cm宽、0.2cm厚 （2）根据所取的材料要求和实验的需要，选择合适的固定液， （3）固定时间，根据组织块的大小和气温,可按具体情况增减，一般以24小时为宜， （4）固定液的量，一般以组织的大小30倍 为宜，可在固定组织的器皿底下垫上脱脂棉或纱布，使固定液渗透组织
11、均匀。 （5）柔软的新鲜组织不易切成小块，先整体固定或注射固定，使组织硬化后再切成小块继续固定。 （二）组织冲洗 组织经固定液固定后，一般必须用水冲洗， 冲洗的目的。一方面是停止固定液对组织,继续固定，另一方面是除去组织中的固定液， （1）瓶装冲洗法、将固定好的组织放入广口瓶内，在瓶口上系好纱布，用一根橡皮管，一头插入瓶口内，一头接上水龙头上，开启一定的水流量，冲洗24小时。 （2）水槽冲洗法、用一个有机玻璃制作的水槽盒，将固定好的组织倒入水槽盒内，在水龙头下，开启一定的水流量，冲洗24 小时。,（四）组织脱水 组织经水冲洗后,含有较多的水分，必须用脱水剂除去组织内所含的的水分，才能进行下一步
12、组织透明和石蜡包埋，在普通组织学制片中，脱水剂的种类很多，通常多用酒精脱水，脱水剂在任何条件下必须都能与水混合，同时又能与透明剂混合，为了减少组织的收缩和硬脆，脱水剂由低浓度到高浓度逐级上升，脱水的时间应根据组织块体积和厚度而定。,组织脱水过程和时间 23mm厚的组织脱水时间 50% 6-8小时 95% （2）2-4小时 70% 6-8小时 100%（1）1-2小时 80% 4-6小时 100%（2）1-2小时 95%（1） 2-4小时 （五）组织透明 组织经酒精脱水后，还不能进行浸蜡包埋， 因组织内含有酒精成分，酒精不能与石蜡混合，需要经过一种酒精与石蜡之间的媒,浸物，即透明剂，透明剂即能与
13、酒精混合又能与石蜡混合，透明剂则能取代酒精，使组织成透明状态，液状石蜡能取代透明剂而浸入组织间隙中，这样便十顺利的达到组织埋藏的目的。在组织学中透明剂的种类很多，一般常用的透明剂是二甲苯，易挥发，有一定毒性，透明力强，组织在二甲苯中时间不宜过久，否则组织易收缩变硬变脆，在浸入二甲苯透明之前，组织必须经二甲苯和纯酒精各半的混合液中过度，然后再进入二甲苯透明，,透明时间 二甲苯纯酒精液中2-3小时 二甲苯（1）中 1-2小时 二甲苯（2）中 1-2小时 （六）组织浸蜡 浸蜡是石蜡包埋的重要过程,将透明的组织进入熔化的石蜡中,让液状石蜡通过组织的间隙浸透到组织中去,然后包埋成组织蜡块,便于石蜡切片。
14、石蜡分为软蜡和硬蜡,熔点在54-56为软蜡,熔点在56-58或60-62为硬蜡，组织浸蜡先软蜡后硬蜡。,组织浸蜡的过程和时间 组织浸蜡的全过程必须在60的恒温箱中进行，在恒温箱内放入2-4个蜡杯，分别放入软蜡和硬蜡使之熔化，将已透明的组织放入软蜡浸20分钟，然后移硬蜡浸40分钟，组织体积的大小与浸蜡的时间有关，请参看组织学与组织化学一书的34页表格。 （七）组织包埋 组织浸蜡完毕后，要进行石蜡包埋， 石蜡包埋操作过程,（1）组织进入硬蜡后，开始作包埋准备。 （2）将金属包埋框装好在保温台上。 （3）将熔点为60-62石蜡置电炉上熔化，温度控制在65左右， （4）点燃酒精灯，准备好无齿镊，需作标
15、记的写好标签， （5）包埋开始，将熔化的包埋石蜡（温度在65左右）倒入金属包埋框内，倒满为即可， （6）用无齿镊从60恒温内把浸好硬蜡的,组织取出迅速放入包埋框内，待冷却凝固。 石蜡包埋注意事项 （1）组织从硬蜡中取出放入包埋框内要快,不能在空间停留过久，否则组织表面上的蜡会被凝固. （2）组织包埋时,要确定组织切面和方向。 （八）组织修块 将已凝固的蜡条从包埋框取出，修成蜡块,在修块时刀子不能挨着组织切下去,蜡块四周要留0.2cm的蜡边.蜡块修好后放入冰箱中保存备用.,(九)组织切片 （1）磨好切片刀，刀口要锋利，用显微镜 检查刀口有无缺口， （2）把被切的蜡块固定在切片机的载物头上，调整蜡
16、块平面。 （3）把切片刀固定在切片机的刀架上，调整好蜡块与刀口的距离，调整切片厚度，一般4-6微米，摇动切片机切片。 石蜡切片常遇到的问题和解决的方法，见组织学与组织化学技术一书的40-41页。,（十）组织贴片 贴片方法有三种 （1）直接贴片法 （2）伸展器贴片法 （3）温水漂浮贴片法 （十一）烤片 （十二）组织染色 染色的步骤 （1）组织脱蜡（二甲苯1）10-15分钟 （2）组织脱蜡（二甲苯2）3-5分钟 （3）组织进入100%酒精 2-3分钟,（4）组织进入95%酒精 2-3分钟 （5）组织进入70%酒精 2-3分钟 如固含有汞的固定液固定的组织必须进入 碘酒精去汞， （6）组织进入1%碘
17、酒精 2-3分钟 （7）自来水洗 0,5-1分钟 （8）5%硫代硫酸钠 1-2分钟 （9）自来水洗 0,5-1分钟 （10）蒸馏水洗 0.5-1分钟 （11）组织进入苏木精染色 10-15分钟,（12）自来水洗 0,5-1分钟 （13）0.5%盐酸酒精分色 10-20秒 （14）自来水洗 0,5-1分钟 （15）在普通水中蓝化 10-15分钟 （16）进入伊红染色 3-5分钟 （17）进入95%酒精 （1）分色 1-3分钟 （18）进入95%酒精 （2）脱水 2-3分钟 （19）进入100%酒精（1）脱水 2-3分钟 （20）进入1005酒精（2）脱水 2-5分钟 （21）进入二甲苯（1）透明
18、30分钟-1小时,（22）进入二甲苯（2）透明30分钟 （23）用中性树胶封固 （24）结果观察 四玻璃器皿的清洗 （1）脏的玻璃器皿在水中浸泡1-2天 （2）用毛刷和肥皂粉刷洗干净，在流水下冲洗干净晾干,入硫酸洗涤剂中浸泡1-2天， （3）从硫酸洗涤剂中捞出，在流水下冲洗数小时，尽量把酸冲洗干净，然后再一个一个的在流水冲洗干净，最后用双蒸水刷洗1-2次，进入60的,烤箱烤干备用。 五、盖玻片的清洗 （1）将盖玻片放入浓盐酸中浸泡2-3天， （2）从浓盐酸中捞出盖玻片，在流水下冲洗数小时,尽量把酸冲洗干净。 （3）将冲洗好的盖玻片放入烧杯中，用蒸馏水刷洗2-3次，尽量把水沥干。 （4）将95%
19、或100%的酒精倒入烧杯中进行脱水处理1-2次，在烧杯口上用吸水纸盖好系紧绳子，然后放入60温箱中烤干备用。,六、载玻片的清洗 （1）将载玻片放入浓盐酸中浸泡1-2天， （2）从浓盐酸中捞出载玻片，在流水下冲洗数小时,尽量把酸冲洗干净。用蒸馏水刷洗2-3次，最好用干净的棉布将载玻片擦干，放入60温箱中烤干。如用于免疫组化,则 用多聚赖氨酸浸泡数秒沥干,放入60温箱中烤干备用。 七、玻璃器皿洗涤剂配法,较强：重铬酸钾 60g 蒸馏水 300ml 浓硫酸 460ml 配法：称取重铬酸钾 60g，加普通水300ml 置电炉上加温使重铬酸钾全部溶解， 待冷却后，慢慢的加入浓硫酸，边 加边搅拌，如有发热，停下冷却后 再加。,
