1、1,真菌毒素检测技术交流,农业部食品质量监督检验测试中心（上海） 黄菲菲,2,常见的真菌毒素的种类 毒素的分布 毒素的检测方法 毒素的检测标准,3,真菌毒素,4,5,黄曲霉毒素,4种主要的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2，加上代谢物M1可以直接地污染食品和饲料。 在所有真菌毒素中，黄曲霉毒素B1的毒性、致癌性、污染频率均居首位。 黄曲霉毒素B1是已知各种真菌毒素中最稳定的一种。,在紫外线下，黄曲霉毒素B1、 B2发兰色荧光，黄曲霉毒素G1、G2发绿色荧光。 黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在体内经过羟化而衍生成的代谢产物。 黄曲霉毒素的分子量为312-346。难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿
2、等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。,7,黄曲霉毒素,黄曲霉毒素常常存在于土壤、动植物、各种坚果特别是花生和核桃中。在大豆、稻谷、玉米、通心粉、调味品、牛奶、奶制品、食用油等制品中也经常发现黄曲霉毒素。一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。,8,赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）,赭曲霉毒素是赭色曲霉属（Ochraceors）和几种青霉属真菌产生的一种毒素，包括A、B、C等7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A毒性最大。赭曲霉毒素A是稳定的无色结晶化合物，溶于极性溶剂和稀碳酸氢钠溶液，微溶于水。,9,赭曲霉毒素A,赭曲霉毒素A会对多种食用了受其污染饲料的家畜和野
3、生动物的肾脏造成损害。一般容易感染赭曲霉毒素A的商品包括：大豆、绿豆、绿咖啡豆、酒、啤酒、葡萄汁、调味品、草本植物、猪肾。,10,伏马毒素（Fumonisins）,伏马菌素是1989年发现的一种新型毒素 白色粉末，易溶于水、甲醇及乙腈-水中。伏马菌素在乙腈-水(1+1)中稳定，在25C下可保存6个月 目前至少已鉴定出15种不同的伏马菌素的类似物，但大部分在自然界未被分离到。伏马菌素B1和B2是自然界存在最普遍，且毒性最强,11,伏马毒素,伏马菌素大多存在于玉米及玉米制品中，其含量一般超过1mg/kg，研究证实，在大米、面条、调味品、高粱、啤酒中也有较低浓度的伏马菌素存在。,12,呕吐毒素 （d
4、eoxynivalenol，DON）,呕吐毒素(Vomitoxin)又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，主要产生菌是禾谷镰刀菌。它可导致动物肠功能紊乱(腹泻，呕吐)，口腔黏膜和真皮损伤，免疫力下降。当呕吐毒素含量超过1 mgkg时，就会引起猪采食量减少，体增重减慢。当饲料中呕吐毒素的浓度达4 mgkg以上时，会导致采食量严重下降、拒食、生产性能降低。呕吐毒素一般在大麦、小麦、玉米、燕麦中含有较高的浓度，在黑麦、高粱、大米中的浓度较低。,13,T-2毒素,是单端孢霉烯族化合物之一 它广泛分布于自然界，是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素，对人、畜危害较大。 197
5、3年联合国粮农组织（FAQ）和世界卫生组织（WHO）在日内瓦召开的联席会议上，把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在的最危险的食品污染源，尤其是美国指责前苏联、越南在东南亚使用“黄雨（yellow rain）”毒素（其中含有T-2毒素）以后，有关T-2毒素对人类健康的危害引起了各国科学家的较大关注,14,展青霉素,展青霉素还具有致畸性、致突变性和致癌性。 主要存在于霉烂的苹果和山楂中,15,玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZON),玉米赤霉烯酮主要存在于玉米、玉米制品、干草和青贮饲料中，小麦、大麦、高粱、大米、小米、芝麻中也有一定程度的分布。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、麦类、谷物等。 玉米赤
6、霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来经济损失。饲料中1mg/kg的玉米赤霉烯酮就会使动物产生雌性化，更高的浓度（50-100mg/kg）将会对怀孕、排卵、移植、胎儿的发育、新生动物儿的生存力产生不利的影响。,16,展青霉素,无色结晶，分子式C7H6O4，相对分子质量154，熔点为110，溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯和三氯甲烷，微溶于乙醚和苯，不溶于石油醚。在酸性环境中展青霉素非常稳定，加工过程中不被破坏。但在碱性溶液中不稳定，其生物活性被破坏。展青霉素也称为棒曲霉素,17,限量要求,18,19,20,
7、21,22,23,24,真菌毒素的检测步骤,25,取样,27,提取,提取剂：乙腈-水或甲醇-水 提取方式：振荡或均质,28,净化,液液萃取 固相萃取净化 多功能柱净化 免疫亲和净化,29,液液萃取,液液萃取是利用相似相溶的原则,选择适当的溶剂和萃取条件, 从混合物中萃取黄曲霉毒素,从而达到分离的目的。液液萃取法设备简单,操作快速,特别是分离效果好,故应用广泛.缺点是费时,工作量较大;萃取溶剂常是易挥发、易燃和有毒的物质，所以在应用上受到限制。,30,固相萃取净化,优点： 1)不需要使用大量有机溶剂,减少对环境的污染。 2)有效地将分析物与干扰组分分离，减少测定时的杂质干扰。 3）能处理小体积试
8、样。 4）回收率高，重现性好。 4）固相萃取柱有较长的保质期。 缺点： 1)非特异性 2)耗时,31,多功能柱净化,优点： 使用方便、快捷 多功能柱有较长的保质期 可用于多种毒素的分析缺点： 非特异性,32,免疫亲和净化,免疫亲和净化法结合了单克隆抗体技术和亲和柱技术，利用抗原-抗体免疫反应的原理，选择性吸附提取液中的毒素，以达到分离净化的目的,优点： 特异性强、净化效果好 缺点： 耗时 用于单一毒素的测定 价格比较贵、保存需冷藏,33,分析,定量：高效液相色谱法LC-MS/GC-MS 半定量薄层色谱酶联免疫法,35,36,黄曲霉毒素的分析方法,分析方法 薄层色谱法酶联免疫法ELISA免疫亲和
9、分光光度法免疫亲和-高效液相色谱法,37,薄层色谱法,TLC法能够容易地决定毒素是否存在, 而对于毒素的定量分析只有在结合密度扫描的情况下，才能完成。薄层色谱法是黄曲霉毒素检测中的经典方法，传统的TLC法样品前处理繁琐且净化效果欠佳，使用双向展开进一步增加了操作步骤和时间。采用新型的净化方式如固相萃取或免疫亲和柱净化结合TLC，实现了单向展开，能缩短部分检测时间。近年来，随着HPLC法的迅猛发展，TLC法已逐渐被HPLC法替代。,38,免疫亲和层析净化高效液相色谱法,GB/T18979-2003食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法,39,黄曲霉毒素M1的分析方法,
10、黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1在动物体内的代谢产物，并能够进入乳汁，因此对黄曲霉毒素M1的检测对象一般都是及动物的组织、乳及其制品。目前，黄曲霉毒素M1的检测方法有薄层色谱法（TLC）、酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫亲和柱层析净化荧光光度法（IA-Fluorometer）和免疫亲和柱层析净化高效液相色谱法（IA-HPLC）和液相色谱法（HPLC）等。,40,薄层色谱法（TLC）（GB/T 5009.24-2003） 酶联免疫吸附法（ELISA） 免疫亲和柱层析净化荧光光度法（IA-FLUOROMETER）和免疫亲和柱层析净化高效液相色谱法（IA-HPLC）（GB/T 18980-2003）
11、,41,GB/T 8381-2008饲料中黄曲霉毒素B1的测定 半定量薄层色谱法 GB/T 17480-2008饲料中黄曲霉毒素B1的测定 酶联免疫吸附法 LOD 0.1 ug/kg NY/T1664-2008 牛乳中黄曲霉M1的快速检测 双流向酶联免疫法 LOD 0.5 ug/kg SN/T1664-2005牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2含量的测定HPLC 法 免疫亲和柱净化，经三氟乙酸衍生后，HPLC 测定 LOD奶粉0.08 ug/kg 牛奶0.008 ug/L,42,GB/T18979-2003食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法 GB
12、/T 18980-2003 乳和乳粉中黄曲霉毒素M,的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法 GB/T5009.23-2003食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定 薄层色谱法 微柱法 液相色谱法-多功能柱净化-三氟乙酸衍生,43,44,T-2毒素,GB/T 5009.118-2008 谷物中T-2毒素的测定HPLC 法 免疫亲和柱净化，衍生后，HPLC 测定 LOD 10ug/kgELISA LOD 1 ug/kgELISA LOD 1 ug/kg SN/T1771-2006 进口粮谷中T-2毒素的测定 HPLC 法 免疫亲和柱净化，衍生后，HPLC 测定 LOD 10ug/
13、kg,45,赭曲霉毒素A的测定方法,GB/T5009.96-2003 谷物和大豆中赭曲霉毒素A的测定方法 TLC 法 LOD 10 ug/kg GB/T19539-2004 饲料中赭曲霉毒素A的测定 TLC 法 LOD 2ngELISA LOD 0.05ng,46,玉米赤霉烯酮,GB/T19540-2004 饲料中玉米赤霉烯酮的测定 TLC 法 LOD 20 ngELISA LOD 0.25ng,47,呕吐毒素,GB/T5009.111-2003 谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定（呕吐毒素）TLC 法 LOD 0.1mg/kgELISA LOD 0.1ng/kg,展青霉素,NY/T165
14、0-2008苹果及山楂制品中展青霉素的测定 高效液相色谱法 乙腈提取，Mycosep228多功能柱净化LOD 液体样品 8 ug/L 固体样品 10 ug/ kg SN/T1859-2007 饮料中棒曲霉素和5-羟甲基糠醛的测定方法 液相色谱-质普法和气相色谱-质谱法LC-MS 乙酸乙酯提取，碳酸钠净化，LOD 10 ug/LGC-MS 乙酸乙酯提取，碳酸钠净化,经BSTFA衍生 LOD 10 ug/LGB/T5009.185-2003苹果及山楂制品中展青霉素的测定 薄层色谱法,49,50,我国目前国家标准存在的问题,51,能力验证,FAPAS食品分析能力评价体系由英国农业渔业和食品部创办于1
15、990年，由英国政府通过位于约克的中心科学实验室CSL（Central Science Laboratory）负责管理，属于非赢利性的官方组织。,52,英国FAPAS分析实验室能力验证是专门从事食品、水质、化工等检测方面的能力验证机构，通过实验室间测试结果的比对来判定实验室能力的合格评定活动。通过开展能力验证，可发现实验室存在的问题和监控实验室的运行状态，提高实验室检测能力和检测水平，确保检测出证的质量。该体系在全世界各国的食品分析实验室迅速普及，目前它已是食品分析领域全球第一的国际评价体系。同时FAPAS所提供目前世界上最广泛的测试材料。,53,本中心参加的毒素方面的能力验证-结果均为满意,
16、奶粉中黄曲霉M1的测定-2006.09 牛奶中黄曲霉M1的测定-2007.01 谷物中赭曲霉毒素A的测定-2007.09 早餐谷物中玉米赤霉烯酮的测定-2008.01 花生中黄曲霉B1、B2、G1、G2及黄曲霉总量的测定-2008.07 燕麦片中T-2毒素的测定-2009.01,54,花生中黄曲霉总量的测定,称样 提取 乙腈：水=60：40匀浆机均质 净化：采用Afla Star Fit,55,56,色谱条件,色谱柱：C18，5 m，250 mm4.6 mm(i.d.)，或性能相当者； 流动相：甲醇：水=45：55； 流速：1.0 mL/min； 检测波长：360/440 nm； 柱温：30
17、； 进样量：50 L 光化学衍生。,57,黄曲霉毒素标准溶液色谱图,58,59,牛奶中黄曲霉M1的测定 GB/T 18980-2003 乳和乳粉中黄曲霉毒素M1,的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法,60,牛奶中黄曲霉M1的测定,61,62,63,谷物中赭曲霉毒素A 的测定,64,65,66,早餐谷物中玉米赤霉烯酮的测定,67,68,燕麦片中T-2毒素的测定,GB/T 5009.118-2008 谷物中T-2毒素的测定 HPLC 法 免疫亲和柱净化，衍生， SN/T1771-2006 进口粮谷中T-2毒素的测定 液相方法存在问题,69,GC-MS法,采用Mycosep 227Tr
18、icho多功能净化柱 经BSFTA 衍生,70,ELISA方法：,71,燕麦片中T-2毒素的测定-LC-MS/MS,称样 提取 乙腈：水=84：16匀浆机均质 净化：采用Mycosep 227Tricho多功能净化柱,72,73,燕麦片中T-2毒素的测定,74,75,其他,苹果及山楂制品中展青霉素的测定 猪肾中赭曲霉毒素A的检测,76,NY/T1650-2008苹果及山楂制品中展青霉素的测定 高效液相色谱法,样品提取： 液体样品：乙腈提取 固体样品：加入果胶酶，40 下放置2h 净化：Mycosep228多功能净化柱,77,色谱条件,色谱柱：C18，5 m，250 mm4.6 mm(i.d.)
19、，或性能相当者； 流动相：四氢呋喃溶液； 流速：1.0 mL/min； 检测波长：276 nm； 柱温：30 ； 进样量：10 L。,78,羟甲基糠醛与棒曲霉素标准溶液色谱图,79,氮气吹干时温度的影响,80,本方法与传统乙酸乙酯提取方法的比较,果胶酶对测定结果的影响,82,线性,5g/L1000g/L范围内，展青霉素的标准溶液与峰面积响应值之间存在着较好的线性关系，相关系数R2为0.999，回归方程分别为Y0.664x - 0.6178,83,84,85,本方法的优势,一步净化，操作方便、快捷； 准确度、精密度高； 增加对固体、半固体样品的前处理过程，对这类样品的检测提供了检测依据； 检出限
20、液体样品 8 ug/L 固体样品 10 ug/ kg能够满足测定要求,86,展青霉素-液相色谱-串联质谱方法,用LC-MS/MS测定浓度梯度的展青霉素标准溶液，其测定结果表明展青素的标准溶液与峰面积响应值之间存在着较好的线性关系，相关系数R2为0.997，回归方程分别为Y14.6528x+9.93589,87,88,关于棒曲霉液相色谱串联质谱方法几点需要说明的问题：,因为展青霉素的紫外吸收比较强，所以质谱方法不是最优的方法， 质谱对进样溶剂的选择性非常强，进过比较发现，纯水或者一定比例的乙腈水混合溶液都不是最好的，只有纯乙腈是最好的选择。但是比较图谱发现纯水溶解的样品图中左侧有一较大的干扰峰。
21、见图1中上面一幅为纯水溶解，下面为纯乙腈溶解的，干扰明显小。保留时间也略有差别。,89,猪肾中赭曲霉毒素A的检测,针对动物肾脏中可能污染的赭曲霉毒素A，建立了肾脏中赭曲霉毒素A（OTA）的高效液相色谱方法。试样用磷酸酸化后经乙酸乙酯提取，免疫亲和柱净化，以乙腈-水-冰醋酸（450+525+25）为流动相，C18柱分离并通过荧光检测器定量。,90,色谱条件,色谱柱 ODS C18柱，150 mm46 mm(i.d.), 粒径5 m； 流动相：乙腈-水-冰醋酸溶（450+525+25）； 流速 1.0 ml/min； 柱温 30 ； 荧光检测器：激发波长 330 nm，发射波长 460nm； 进样
22、量：50 L。,91,线性,本方法中赭曲霉毒素A标准溶液浓度在0.1020 g/L范围内呈线性相关线性方程：Y13178X-376.72（r=1）检出限当信噪比SN=3，取样量为5 g，定容体积为0.5 m1时，本方法的检出限（LOD）为0.012 g/kg。,92,准确度及精密度,93,94,猪肾样品进行赭曲霉毒素A的测定,选择10个猪肾样品进行OTA测定，测定结果有8个样品为未检出，有2个样品为阳性，含量分别为0.092 g/kg、0.64 g/kg。,95,结论,本方法采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱法检测猪肾中的赭曲霉毒素A含量。对猪肾分别进行了002、010、0.50 g/kg 3个浓度的加标回收，添加回收率为72.5 %87.4 %，检出限为0.012g/kg。使用免疫亲和柱净化能够达到良好的净化效果，是一种准确、方便的测定猪肾中赭曲霉毒素A的分析方法。,96,白酒中赭曲霉毒素A的检测,97,咖啡中赭曲霉毒素A的检测,经免疫亲和柱净化 回收率,100,谢谢！,
