1、Snapshot 技术平台SnaPshot 技术平台是 Applied Biosystems,ABI 公司推出了专为检测 SNP 设计的分析软件和试剂盒可对多个 SNP 位点同时进行基因分型 ,也被称为 minisequencing 。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物 SNaPshot 反应后 ,产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper 分析 ,可在 一次电泳胶 内检测 多个 SNP 位点。这个平台是建立在3730，3130 等 PCR 测序仪上的技术。3730XL 型 DNA 序列检测仪一. SnaPshot 工作原理应用 SNaPshot 进行定点的序列分析 ,其基本
2、原理遵循了 DNA 直接测序中的双脱氧终止法 ,所不同的是 PCR 反应中只有不同荧光标记的 ddNTP。由于每个 SNP 位点的引物 3端都紧靠 SNP 点 ,因此每一种引物在聚合酶作用下 ,根据模板的的序列 ,只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统 ,检测延伸的那个核苷酸的种类。1多重 SNaPshot 反应的工作原理： 在一个 SNaPshot 反应体系中， 针对每个待测 SNP 位点 在其上游或下游设计一条单向的寡核苷酸引物（正向引物或反向引物） ，引物的Tm 值要求在 50 度以上 ，在 AmpliTaq 聚合酶和 4 种不同荧光标.记的 ddNTP 存在的情况下,各条引物与各自
3、互补的 DNA 模板结合, 聚合酶在引物的 3末端延伸单个碱基反应即告终止,产物的长度为引物长度+1bp。延伸的碱基就是该样本在该位点上的基因型 ，其中纯合子表现为单峰，杂合子表现为双峰 。为了能够分辨不同 SNP 的不同基因型，可在引物的 5末端加上不同长度的 Poly C 或 Poly T，使各条引物以长度区分。经电泳将其分开。最短的引物一般设定为 20bp, 相邻两个 SNP 的引物之间长度一般相差 4-6 个核苷酸，以便区分。 多重 SNaPshot 反应即利用引物间长度的差异和单碱基延伸 4 种荧光标记的 ddNTP 而最终达到区分不同 SNP 位点的作用, 一次反应可以同时对 4-
4、5 个 SNP 进行基因分型, 是一种通量较高的基因分型的方法。图 1 SnaPshot 实验原理图解2多重 SNaPshot 反应的工作通量工作的进度取决于多重 PCR 和 EXTENSION 的条件优化过程。还有测序仪的通量也是很重要的，3730 每天可以做 16 次 96 道电泳，如果每次出 4 个位点，那每天的通量就是 6000个 GENOTYPING，是中等通量的检测。二. SnaPshot 工作流程1 引物的设计SNAPSHOT 可以检测多重的 SNP，我们一般选择 45 个位点做一个组合。现对这些目的SNP 进行引物的设计。每个 SNP 设计 3 条引物，其中 2 条是目的片段的
5、扩增，长度在200500bp 左右，Tm 值在 60 度左右。第 3 条的引物的是延伸 ddNTP,设计在 SNP 位点的上游或者是反向的下游。 引物设计注意事项：1 同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差 4-6 个碱基。2 引物与模板互补部分（有效引物）的 Tm 值至少要 50 C。3 为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的 5端加 poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者 poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因 3端的 poly(dA)尾巴互补。4 引物在毛细管中的
6、迁移受引物长度、碱基组成、标记的荧光染料等因素影响。引物越短，影响越显著，越有可能偏离仅仅根据片段长度预期的引物迁移距离。当引物长度小于 36 个碱基时，ABI 强烈建议用户使用 Primer Focus 试剂盒做预实验，确定各种引物在多重电泳中的精确迁移距离。5 合成长度大于 30 个碱基的引物时，建议采用 HPLC 方法纯化。6 在引物设计的时候，如果+链 DNA 的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用-链 DNA 设计引物。进行多重 SNaPshot 反应时 ,需多条引物和多个模板同时进行。为了保持反应的一致性 ,对引物的设计要求是尽量保持相近的 Tm 值 ,否则会引起非特异性产物的扩
7、增 ,造成碱基误读。另外 ,反应混合液中不同模板和其对应引物的量还应选择合适比例。与单重 SNaPshot 反应相比 ,多重反应不但节省了反应时间 ,还大大减少了试剂用量 ,降低了反应成本。位点 SNP PCR LEFT PRIMER TM PCR RIGHT PRIMER TM 长度SNP1 c/t GAGCCAGAGGAGGATGTTGA 60.35 GGCTAGAAGGAGCGAGGACT 60.12 248SNP2 C/T ACGTTGCAGTTGCCTTTCTT 59.92 GACTCTGCAGTGAGGCCCTA 60.55 210SNP3 A/G CCTTGATACCACGTGC
8、ATTG 59.99 TTCTTCAGCCTCTGCCATTT 59.96 185SNP4 C/G TCAAGCCCAGTCCTTTCTGT 59.84 CCCAATAGCCGTATCTGGAA 59.92 296位点 延伸引物 TM 方向 产物长度 Nts addedSNP1 CGATCATAGTCAGCTGGCCT 60.4 R 20 A/GSNP2 cccccccc-GGCACGGTACCTGGGCT 62.1 L 25 C/TSNP3 cccccccc-TCATCAATTGCTGAGGACAGAG 60.4 L 30 A/GSNP4 ccccccccccccc-AACTCTGGGAGA
9、TTCTCCTATTGAC 60.36 L 38 C/G2 片段扩增 引物稀释,将 2OD 的引物稀释到 100mM.加入的 TE 的量为 660000/MW如分子量为 7003，则加入 660000/7003=94.2ul做试验前将一组的引物加 DDH2O 稀释成 10mM.反应体系：用 量 10Buffer (15Mm Mg2 ) 1 LPrimer (10Mm) 0.4 LdNTP(10Mm) 0.3 LHotStar (5u/ul) 0.1 LDNA 1 LMg2 (25Mm) 0.52 LddH2O 6.68 L Total Volume 10 L多重 PCR 反应采用 Touchd
10、own 的 PCR 反应程序:95 15 min;94 40 s, 63 1 min 每个循环下降 0.5 ,72 1.5 min,1 5 个循环;94 40 s,56 40 s,72 1.5 min, 25 个循环;72 8 min; 结束后 4 保存。PCR产物经琼脂糖电泳检测有片段的表明实验成功。多重PCR产物凝胶电泳3 PCR 产物的纯化 多色 SNP 实验的模板 DNA 可以是质粒，也可以是 PCR 产物(0.01 到 0.4 pmol)。质粒可以直接用于反应，但 PCR 产物必须先作好纯化， SAP 酶将残余 dNTPs 去磷酸化, ExoI 降解游离单链引物。（1）纯化酶：SAP
11、和Exo I（2）作用原理：SAP 去除多余的dNTP和引物Exo I 去除单链引物和其他单链 DNA产物（3）反应体系：PCR产物6L 2L酶混合液（含2U SAP和2U ExoI），振荡混匀（4）反应条件：37 C 孵育保温 1 hr，然后75 C 保温15 min以灭活SAP和Exo I酶。纯化好的模板可以在4 C保存24 hr或-20 C 长期保存。4SNaPshot PCR混合模板： 如果以 PCR 产物作为 SNaPshot PCR 的模板，在纯化好后，每种各取 2 L，混合。混合 SNaPshot 的 PCR 引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为 0.2 M。混合SNaPsh
12、ot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 M。( 每个SNP引物加1-2ul 到 500ulDDH2O中)SNaPshot PCR：用量 (L / Sample)标准品 (L)Reaction Mix 0.5 5Pooled PCR Products 2 2Pooled Primers 1.2 1dH2O 1.3 2 总体积 5 L 10 LPCR 循环条件为：96 C 10 sec (96 C 10 sec 50 C(53C)5 sec 60 C 30 sec) 25 循环 60 C 30 sec 4 C5SNaPshot PCR 产物的纯化在 5 L 上述 SNaPsho
13、t PCR 产物中加入 0.5USAP 或者 1 U CIP，震荡混匀，37 C 保温1 hr，75 C 保温 15 min 以灭活酶， 4 C 可保存 24 hr 或-20 C 长期保存。6310、3100、3730 电泳样品制备试 剂 用量 (L)Hi-Di Formamide 9.25GS-120 LIZ 0.1SNaPshot产物 1 总体积 10.35 L95 C 变性 5 min 迅速冰冷 4 min。每个电泳样本都加入了 LIZ120 内标，使延伸片段的长度大小可以精确定位。15 20 25 35 50 62 80110 120图 2，liz-120 分子内标电泳峰形7GeneM
14、apper4.0 软件分析图 3.不同样本多重 SNAPSHOT 电泳结果图 4. 1 个 SNP 位点的不同样本的基因型结果，G/A,AA,GG软件分析后输出数据结果Sample Name Marker Allele 1 Allele 2LH005 RS1010 G LH006 RS1010 G ALH007 RS1010 A LH009 RS1010 G ALH010 RS1010 G ALH012 RS1010 G LH014 RS1010 G ALH017 RS1010 G ALH019 RS1010 G LH020 RS1010 G ALH022 RS1010 G ALH024 RS1010 G LH025 RS1010 G LH027 RS1010 A LH028 RS1010 A 三 SnaPshot 技术平台的优点1 引物和探针合成周期短，国内一周之内可以合成完毕。2 可以做多重的 SNP 检测，降低了成本。3 样本数量要求不要，100 到 1000 的样本量都很适合。位点成功率和准确率95。 4
