细胞转染技术原理及应用.pdf

1、细 胞 转 染 技 术 原 理 及 应 用常 规 转 染 技 术 可 分 为 两 大 类 ， 一 类 是 瞬 时 转 染 ， 一 类 是 稳 定 转 染 （ 永 久 转 染 ） 。 前 者 外 源 DNA/RNA不 整 合 到 宿 主染 色 体 中 ， 因 此 一 个 宿 主 细 胞 中 可 存 在 多 个 拷 贝 数 ， 产 生 高 水 平 的 表 达 ， 但 通 常 只 持 续 几 天 ， 多 用 于 启 动 子 和 其 它调 控 元 件 的 分 析 。 一 般 来 说 ， 超 螺 旋 质 粒 DNA 转 染 效 率 较 高 ， 在 转 染 后 24-72 小 时 内 （ 依 赖 于 各

2、种 不 同 的 构 建 ） 分析 结 果 ， 常 常 用 到 一 些 报 告 系 统 如 荧 光 蛋 白 ， 半 乳 糖 苷 酶 等 来 帮 助 检 测 。 后 者 也 称 稳 定 转 染 ， 外 源 DNA 既 可 以 整合 到 宿 主 染 色 体 中 ， 也 可 能 作 为 一 种 游 离 体 （ episome） 存 在 。 尽 管 线 性 DNA比 超 螺 旋 DNA 转 入 量 低 但 整 合 率 高 。外 源 DNA 整 合 到 染 色 体 中 概 率 很 小 ， 大 约 1/104转 染 细 胞 能 整 合 ， 通 常 需 要 通 过 一 些 选 择 性 标 记 ， 如 来 氨

3、丙 基 转 移酶 （ APH； 新 霉 素 抗 性 基 因 ） ， 潮 霉 素 B磷 酸 转 移 酶 （ HPH） ， 胸 苷 激 酶 （ TK） 等 反 复 筛 选 ， 得 到 稳 定 转 染 的 同 源 细胞 系 。转 染 技 术 的 选 择 对 转 染 结 果 影 响 也 很 大 ， 许 多 转 染 方 法 需 要 优 化 DNA 与 转 染 试 剂 比 例 ， 细 胞 数 量 ， 培 养 及 检 测时 间 等 。 一 些 传 统 的 转 染 技 术 ， 如 DEAE右 旋 糖 苷 法 ， 磷 酸 钙 法 ， 电 穿 孔 法 ， 脂 质 体 法 各 有 利 弊 ， 其 主 要 原 理 及

4、 应用 特 点 见 下 表 ：转 染 方 法 原 理 应 用 特 点磷 酸 钙 法磷 酸 钙 DNA复 合 物 吸 附 细 胞 膜 被 细胞 内 吞稳 定 转 染瞬 时 性 转 染不 适 用 于 原 代 细 胞操 作 简 便 但 重 复 性 差有 些 细 胞 不 适 用DEAE-右 旋 糖 苷 法带 正 电 的 DEAE-右 旋 糖 苷 与 核 酸 带负 电 的 磷 酸 骨 架 相 互 作 用 形 成 的 复合 物 被 细 胞 内 吞瞬 时 性 转 染相 对 简 便 、 结 果 可 重 复但 对 细 胞 有 一 定 的 毒 副 作 用转 染 时 需 除 血 清电 穿 孔 法高 脉 冲 电 压

5、破 坏 细 胞 膜 电 位 ， DNA通 过 膜 上 形 成 的 小 孔 导 入稳 定 转 染瞬 时 性 转 染所 有 细 胞适 用 性 广 但 细 胞 致 死 率 高 ， DNA和 细胞 用 量 大 ， 需 根 据 不 同 细 胞 类 型 优化 电 穿 孔 实 验 条 件病 毒 介 导 法通 过 侵 染 宿 主 细 胞 将 外 源 基 因 整 合到 染 色 体 中稳 定 转 染可 用 于 难 转 染 的 细 胞 、 原 代 细 胞 ， 体内 细 胞 等逆 转 录 病 毒 特 定 宿 主 细 胞但 携 带 基 因 不 能 太 大 细 胞 需 处 分 裂期需 考 虑 安 全 因 素腺 病 毒通

6、过 侵 染 宿 主 细 胞 将 外 源 基 因 整 合到 染 色 体 中瞬 时 转 染特 定 宿 主 细 胞可 用 于 难 转 染 的 细 胞需 考 虑 安 全 因 素阳 离 子 脂 质 体 法带 正 电 的 脂 质 体 与 核 酸 带 负 电 的 磷酸 基 团 形 成 复 合 物 被 细 胞 内 吞稳 定 转 染瞬 时 性 转 染所 有 细 胞适 用 性 广 ， 转 染 效 率 高 ， 重 复 性 好 ，但 转 染 时 需 除 血 清 。 转 染 效 果 随 细 胞类 型 变 化 大Biolistic 颗 粒 传 递 法将 DNA用 显 微 重 金 属 颗 粒 沉 淀 ， 再将 包 被 好

7、的 颗 粒 用 弹 道 装 置 投 射 入细 胞 ， DNA在 胞 内 逐 步 释 放 ， 表 达瞬 时 性 转 染可 用 于 ： 人 的 表 皮 细 胞 ， 纤 维 原 细 胞 ，淋 巴 细 胞 系 以 及 原 代 细 胞显 微 注 射 法用 显 微 操 作 将 DNA 直 接 注 入 靶 细 胞核稳 定 转 染瞬 时 性 转 染转 染 细 胞 数 有 限多 用 于 工 程 改 造 或 转 基 因 动 物 的 胚胎 细 胞（ 各 种 转 染 方 法 的 比 较 ）除 上 述 传 统 方 法 外 ， 近 年 来 国 际 上 推 出 了 一 些 阳 离 子 聚 合 物 基 因 转 染 技 术 ，

8、 以 其 适 用 宿 主 范 围 广 ， 操 作 简 便 对细 胞 毒 性 小 ， 转 染 效 率 高 受 到 研 究 者 们 的 青 睐 。 其 中 树 枝 状 聚 合 物 （ Dendrimers） 和 聚 乙 烯 亚 胺 （ Polyethylenimine，PEI） 的 转 染 性 能 最 佳 ， 但 树 枝 状 聚 合 物 的 结 构 不 易 于 进 一 步 改 性 ， 且 其 合 成 工 艺 复 杂 。 聚 乙 烯 亚 胺 是 一 种 具 有 较高 的 阳 离 子 电 荷 密 度 的 有 机 大 分 子 ， 每 相 隔 二 个 碳 个 原 子 ， 即 每 “ 第 三 个 原 子 都

9、 是 质 子 化 的 氨 基 氮 原 子 ， 使 得 聚 合物 网 络 在 任 何 pH 下 都 能 充 当 有 效 的 “ 质 子 海 绵 ” (proton sponge)体 。 这 种 聚 阳 离 子 能 将 各 种 报 告 基 因 转 入 各 种 种属 细 胞 ， 其 效 果 好 于 脂 质 聚 酰 胺 ， 经 进 一 步 的 改 性 后 ， 其 转 染 性 能 好 于 树 枝 状 聚 合 物 ， 而 且 它 的 细 胞 毒 性 低 。 大 量实 验 证 明 ， PEI是 非 常 有 希 望 的 基 因 治 疗 载 体 。 目 前 在 设 计 更 复 杂 的 基 因 载 体 时 ， P

10、EI经 常 做 为 核 心 组 成 成 分 。 线型 PEI（ Line PEI,LPEI） 与 其 衍 生 物 用 作 基 因 转 染 载 体 的 研 究 比 分 枝 状 PEI（ Branched PEI,BPEI） 要 早 一 些 ， 过去 的 研 究 认 为 在 不 考 虑 具 体 条 件 ， LPEI/DNA转 染 复 合 物 的 细 胞 毒 性 较 低 ， 有 利 于 细 胞 定 位 ， 因 此 与 BPEI 相 比 应 该转 染 效 率 高 一 些 。 但 最 近 研 究 表 明 BPEI的 分 枝 度 高 有 利 于 形 成 小 的 转 染 复 合 物 ， 从 而 提 高 转

11、染 效 率 ， 但 同 时 细 胞毒 性 也 增 大 。 超 高 分 枝 的 、 较 柔 性 的 PEI衍 生 物 含 有 额 外 的 仲 胺 基 和 叔 胺 基 ， 在 染 实 验 中 发 现 这 种 PEI 的 毒 性 低 ，但 转 染 效 率 却 较 高 。GenEscort是 采 用 各 种 分 枝 状 和 超 高 分 枝 状 的 小 分 子 PEI与 各 种 含 有 生 理 条 件 下 可 降 解 键 的 交 联 剂 交 联 ， 合 成出 的 一 系 列 高 分 枝 的 可 降 解 的 PEI 衍 生 物 。 聚 合 物 的 分 枝 结 构 使 得 其 具 有 较 高 的 正 电 性

12、 ， 因 此 易 于 高 效 地 包 裹 各 种DNA、 RNA分 子 及 质 粒 形 成 小 的 纳 米 颗 粒 ， 从 而 提 高 转 染 效 率 ， 当 所 形 成 复 合 物 进 入 细 胞 以 后 ， 其 中 所 含 的 生 理 条 件下 可 降 解 的 化 学 键 在 细 胞 内 水 解 ， 使 交 联 聚 合 物 分 解 为 无 细 胞 毒 性 的 小 分 子 PEI， 这 样 结 构 的 转 染 试 剂 在 体 外 应 用可 以 获 得 高 的 转 染 效 率 和 低 的 细 胞 毒 性 ， 其 可 降 解 性 对 体 内 应 用 也 具 有 重 要 的 意 义 。影 响 转

13、染 实 验 的 因 素转 染 技 术 是 指 将 外 源 分 子 如 DNA， RNA等 导 入 真 核 细 胞 的 技 术 。 随 着 分 子 生 物 学 和 细 胞 生物 学 研 究 的 不 断 发 展 ， 转 染 已 经 成 为 研 究 和 控 制 真 核 细 胞 基 因 功 能 的 常 规 工 具 。 在 研 究 基 因功 能 、 调 控 基 因 表 达 、 突 变 分 析 和 蛋 白 质 生 产 等 生 物 学 试 验 中 ， 其 应 用 越 来 越 广 泛 。 影 响 转染 效 率 的 因 素 有 很 多 ， 细 胞 株 本 身 的 特 性 和 活 性 ， 细 胞 培 养 条 件

14、， 转 染 的 DNA 或 RNA 的 质 量 ，转 染 方 法 ， 转 染 试 剂 的 选 择 等 。常 规 转 染 技 术 可 分 为 两 大 类 ， 一 类 是 瞬 时 转 染 ， 一 类 是 稳 定 转 染 （ 永 久 转 染 ） 。 前 者 外 源DNA/RNA 不 整 合 到 宿 主 染 色 体 中 ， 因 此 一 个 宿 主 细 胞 中 可 存 在 多 个 拷 贝 数 ， 产 生 高 水 平 的 表达 ， 但 通 常 只 持 续 几 天 ， 多 用 于 启 动 子 和 其 它 调 控 元 件 的 分 析 。 一 般 来 说 ， 超 螺 旋 质 粒 DNA转 染 效 率 较 高 ，

15、 在 转 染 后 24-72小 时 内 （ 依 赖 于 各 种 不 同 的 构 建 ） 分 析 结 果 ， 常 常 用 到 一 些报 告 系 统 如 荧 光 蛋 白 ， - 半 乳 糖 苷 酶 等 来 帮 助 检 测 。 后 者 也 称 稳 定 转 染 ， 外 源 DNA 既 可以 整 合 到 宿 主 染 色 体 中 ， 也 可 能 作 为 一 种 游 离 体 （ episome） 存 在 。 尽 管 线 性 DNA 比 超 螺 旋DNA 转 入 量 低 但 整 合 率 高 。 外 源 DNA 整 合 到 染 色 体 中 概 率 很 小 ， 大 约 1/104转 染 细 胞 能 整 合 ，通

16、常 需 要 通 过 一 些 选 择 性 标 记 ， 如 来 氨 丙 基 转 移 酶 （ APH； 新 霉 素 抗 性 基 因 ） ， 潮 霉 素 B磷酸 转 移 酶 （ HPH） ， 胸 苷 激 酶 （ TK） 等 反 复 筛 选 ， 得 到 稳 定 转 染 的 同 源 细 胞 系 。转 染 效 率 受 多 种 因 素 影 响 ， 主 要 因 素 有 下 面 几 个 ：1 转 染 试 剂不 同 细 胞 系 转 染 效 率 通 常 不 同 ， 但 细 胞 系 的 选 择 通 常 是 根 据 实 验 的 需 要 ， 因 此 在 转 染实 验 前 应 根 据 实 验 要 求 和 细 胞 特 性 选

17、择 适 合 的 转 染 试 剂 。 每 种 转 染 试 剂 都 会 提 供 一 些 已 经 成功 转 染 的 细 胞 株 列 表 和 文 献 ， 通 过 这 些 资 料 可 选 择 最 适 合 实 验 设 计 的 转 染 试 剂 。 当 然 ， 最 适合 的 是 高 效 、 低 毒 、 方 便 、 廉 价 的 转 染 试 剂 。2 细 胞 状 态一 般 低 的 细 胞 代 数 （ 50） 能 确 保 基 因 型 不 变 。 最 适 合 转 染 的 细 胞 是 经 过 几 次 传 代 后达 到 指 数 生 长 期 的 细 胞 ， 细 胞 生 长 旺 盛 ， 最 容 易 转 染 。 细 胞 培 养

18、 在 实 验 室 中 保 存 数 月 和 数 年后 会 经 历 突 变 ， 总 染 色 体 重 组 或 基 因 调 控 变 化 等 而 演 化 。 这 会 导 致 和 转 染 相 关 的 细 胞 行 为 的变 化 。 也 就 是 说 同 一 种 系 的 细 胞 株 ， 在 各 实 验 室 不 同 培 养 条 件 下 ， 其 生 物 学 性 状 发 生 不 同 程度 的 改 变 ， 导 致 其 转 染 特 性 也 发 生 变 化 。 因 此 ， 如 果 发 现 转 染 效 率 降 低 ， 可 以 试 着 转 染 新 鲜培 养 的 细 胞 以 恢 复 最 佳 结 果 。3 转 染 方 法不 同 转

19、 染 试 剂 有 不 同 的 转 染 方 法 ， 但 大 多 大 同 小 异 。 转 染 时 应 跟 据 具 体 转 染 试 剂 推 荐的 方 法 ， 但 也 要 注 意 ， 因 不 同 实 验 室 培 养 的 细 胞 性 质 不 同 ， 质 粒 定 量 差 异 ， 操 作 手 法 上 的 差异 等 ， 其 转 染 效 果 可 能 不 同 ， 应 根 据 实 验 室 的 具 体 条 件 来 确 定 最 佳 转 染 条 件 。（ 1） 细 胞 培 养 物健 康 的 细 胞 培 养 物 是 成 功 转 染 的 基 础 。 不 同 细 胞 有 不 同 的 培 养 基 ， 血 清 和 添 加 物 。

20、高的 转 染 效 率 需 要 一 定 的 细 胞 密 度 ， 一 般 的 转 染 试 剂 都 会 有 专 门 的 说 明 。 推 荐 在 转 染 前 24 小时 分 细 胞 ， 这 将 提 供 正 常 细 胞 代 谢 ， 增 加 对 外 源 DNA 摄 入 的 可 能 。 一 定 要 避 免 细 菌 ， 支 原 体或 真 菌 的 污 染 。（ 2） 细 胞 密 度细 胞 密 度 对 转 染 效 率 有 一 定 的 影 响 。 不 同 的 转 染 试 剂 ， 要 求 转 染 时 的 最 适 细 胞 密 度 各不 相 同 ， 即 使 同 一 种 试 剂 ， 也 会 因 不 同 的 细 胞 类 型

21、或 应 用 而 异 。 转 染 时 过 高 或 者 过 低 的 细 胞密 度 会 导 致 转 染 效 率 降 低 ， 乃 至 表 达 水 平 偏 低 。 因 此 如 果 选 用 新 的 细 胞 系 或 者 新 的 转 染 试 剂 ，最 好 能 够 进 行 优 化 实 验 并 为 以 后 的 实 验 建 立 一 个 稳 定 方 法 ， 包 括 适 当 的 接 种 量 和 培 养 时 间 等等 。 阳 离 子 脂 质 体 具 有 微 量 的 细 胞 毒 性 而 往 往 需 要 更 高 的 铺 板 密 度 或 者 更 多 的 悬 浮 细 胞 数 ，有 的 要 求 细 胞 90%汇 片 ； 而 有 些

22、 多 胺 或 者 非 脂 质 体 的 配 方 则 要 求 在 40%-80%之 间 ， 总 之 是 尽量 在 细 胞 最 适 的 生 理 状 态 下 转 染 ， 以 求 最 佳 的 转 染 效 果 。 不 同 的 实 验 目 的 也 会 影 响 转 染 时 的铺 板 密 度 ， 比 如 研 究 细 胞 周 期 相 关 基 因 等 表 达 周 期 长 的 基 因 ， 就 需 要 较 低 的 铺 板 密 度 ， 所 以需 要 选 择 能 够 在 较 低 铺 板 密 度 下 进 行 转 染 的 试 剂 。 一 般 转 染 时 贴 壁 细 胞 密 度 为 50%-90%， 但这 个 需 要 参 考 所

23、 选 转 染 试 剂 的 说 明 书 。（ 3） 血 清血 清 一 度 曾 被 认 为 会 降 低 转 染 效 率 ， 老 一 代 的 转 染 方 法 往 往 要 求 转 染 前 后 洗 细 胞 或 者在 无 血 清 培 养 基 条 件 下 转 染 ， 但 有 些 对 此 敏 感 的 细 胞 如 原 代 细 胞 会 受 到 损 伤 ， 甚 至 死 亡 导 致转 染 效 率 极 低 。 不 过 转 染 产 品 配 方 几 经 革 新 后 的 今 天 ， 对 于 主 流 的 转 染 试 剂 来 说 ， 血 清 的 存在 已 经 不 会 影 响 转 染 效 率 ， 甚 至 还 有 助 于 提 高 转

24、 染 效 率 ， 如 阳 离 子 聚 合 物 等 ， 血 清 的 存 在 会影 响 DNA 转 染 复 合 物 的 形 成 ， 但 只 要 在 DNA-转 染 复 合 物 形 成 时 用 无 血 清 培 养 基 或 PBS来 稀释 DNA和 转 染 试 剂 就 可 以 了 ， 在 转 染 过 程 中 是 可 以 使 用 血 清 的 。 不 过 要 特 别 注 意 ： 对 于 RNA转 染 ， 如 何 消 除 血 清 中 潜 在 的 RNase污 染 是 值 得 关 注 的 。 胎 牛 血 清 （ FCS） 经 常 用 到 ， 便 宜一 点 的 有 马 或 牛 血 清 。 通 常 的 ， 血 清

25、 是 一 种 包 含 生 长 因 子 及 其 它 辅 助 因 子 的 不 确 切 成 分 的 添加 物 ， 对 不 同 细 胞 的 生 长 作 用 有 很 大 的 差 别 。 血 清 质 量 的 变 化 直 接 影 响 细 胞 生 长 ， 因 此 也 会影 响 转 染 效 率 。 新 加 培 养 基 的 预 热 对 细 胞 转 染 很 有 帮 助 。（ 4） 抗 生 素细 胞 培 养 过 程 中 往 往 会 添 加 抗 生 素 来 防 止 污 染 ， 但 是 这 些 添 加 剂 可 能 对 转 染 造 成 麻烦 。 比 如 青 霉 素 和 链 霉 素 ， 就 是 影 响 转 染 的 培 养 基

26、 添 加 物 。 这 些 抗 生 素 一 般 对 于 真 核 细 胞 无毒 ， 但 有 些 转 染 试 剂 增 加 了 细 胞 的 通 透 性 ， 使 抗 生 素 可 以 进 入 细 胞 。 这 可 能 间 接 导 致 细 胞 死亡 ， 造 成 转 染 效 率 低 。 目 前 转 染 试 剂 因 为 全 程 都 可 以 用 有 血 清 和 抗 生 素 等 添 加 剂 的 完 全 培 养基 来 操 作 ， 非 常 方 便 ， 省 去 了 污 染 等 麻 烦 。（ 5） 氮 磷 （ N/P） 比N/P比 是 转 染 效 率 的 关 键 （ 为 了 换 算 方 便 ， 一 般 以 DNA/转 染 试

27、 剂 质 量 比 表 示 ） ， 在 一定 比 例 范 围 内 转 染 效 率 随 N/P 比 成 比 例 增 高 ， 之 后 达 到 平 值 ， 但 毒 性 也 随 之 而 增 加 ， 因 此 在实 验 之 前 应 根 据 推 荐 比 例 ， 确 定 本 实 验 的 最 佳 转 染 比 例 。（ 6） DNA质 量DNA质 量 对 转 染 效 率 影 响 非 常 大 。 一 般 的 转 染 技 术 （ 如 脂 质 体 等 ） 基 于 电 荷 吸 引 原 理 ，如 果 DNA 不 纯 ， 如 带 少 量 的 盐 离 子 ， 蛋 白 ， 代 谢 物 污 染 都 会 显 著 影 响 转 染 复 合

28、 物 的 有 效 形 成及 转 染 的 进 行 ， 但 对 GenEscort系 列 转 染 试 剂 影 响 不 大 。 核 酸 纯 化 世 界 第 一 品 牌 德 国 QIAGEN公 司 提 供 的 超 纯 质 粒 抽 提 试 剂 盒 ， 能 达 到 两 倍 2 CsCl 梯 度 离 心 以 上 的 纯 度 效 果 ， 使 您 不 必为 DNA质 量 操 心 。 此 外 ， 对 一 些 内 毒 素 敏 感 的 细 胞 （ 如 原 代 细 胞 ， 悬 浮 细 胞 和 造 血 细 胞 ） ，QIAGEN 还 提 供 可 去 除 内 毒 素 污 染 的 质 粒 抽 提 试 剂 盒 ， 在 质 粒

29、抽 提 过 程 中 有 效 去 除 脂 多 糖 分子 ， 保 证 理 想 的 转 染 效 果 。 但 如 果 使 用 GenEscort转 染 试 剂 ， 一 般 不 需 要 这 么 高 的 DNA质 量要 求 。 当 使 用 GenEscort转 染 试 剂 时 ， 即 使 采 用 传 统 的 酚 氯 仿 沉 淀 方 法 纯 化 质 粒 ， 仍 然 可达 到 非 常 好 的 转 染 效 果 ， 但 所 用 的 质 粒 量 比 试 剂 盒 纯 化 方 法 的 DNA用 量 大 一 些 。4 载 体 构 建转 染 载 体 的 构 建 （ 病 毒 载 体 ， 质 粒 DNA， RNA， PCR 产

30、 物 ， 寡 核 苷 酸 等 ） 也 影 响 转 染 结果 。 病 毒 载 体 对 特 定 宿 主 细 胞 感 染 效 率 较 高 ， 但 不 同 病 毒 载 体 有 其 特 定 的 宿 主 ， 有 的 还 要 求特 定 的 细 胞 周 期 ， 如 逆 转 录 病 毒 需 侵 染 分 裂 期 的 宿 主 细 胞 ， 此 外 还 需 考 虑 一 些 安 全 问 题 （ 如基 因 污 染 ） 。 除 载 体 构 建 外 ， 载 体 的 形 态 及 大 小 对 转 染 效 率 也 有 不 同 的 影 响 ， 如 前 面 提 到 的超 螺 旋 及 线 性 DNA 对 瞬 时 和 稳 定 转 染 的 影

31、 响 。 如 果 基 因 产 物 对 细 胞 有 毒 性 作 用 ， 转 染 也 很 难进 行 ， 因 此 选 择 组 成 或 可 调 控 ， 强 度 合 适 的 启 动 子 也 很 重 要 ， 同 时 做 空 载 体 及 其 它 基 因 的 相同 载 体 构 建 的 转 染 正 对 照 可 排 除 毒 性 影 响 的 干 扰转 染 技 术 的 要 点 及 转 染 试 剂 正 确 选 择转 染 技 术 的 要 点 及 转 染 试 剂 正 确 选 择转 染 技 术 是 指 将 外 源 分 子 如 DNA， RNA等 导 入 真 核 细 胞 的 技 术 ， 它 是 研 究 基 因 表 达 调 控

32、，突 变 分 析 等 的 常 规 工 具 。 随 着 功 能 研 究 的 兴 起 ， 其 应 用 越 来 越 广 泛 。 以 下 就 向 大 家 介 绍 一 些转 染 的 技 术 要 点 及 市 面 上 主 要 的 转 染 试 剂 类 型 的 选 择 。常 规 转 染 技 术 可 分 为 两 大 类 ， 一 类 是 瞬 时 转 染 ， 一 类 是 稳 定 转 染 （ 永 久 转 染 ） 。 前 者 外源 DNA/RNA不 整 合 到 宿 主 染 色 体 中 ， 因 此 一 个 宿 主 细 胞 中 可 存 在 多 个 拷 贝 数 ， 产 生 高 水 平 的表 达 ， 但 通 常 只 持 续 几

33、天 ， 多 用 于 启 动 子 和 其 它 调 控 元 件 的 分 析 。 一 般 来 说 ， 超 螺 旋 质 粒DNA 转 染 效 率 较 高 ， 在 转 染 后 24-96小 时 内 （ 依 赖 于 各 种 不 同 的 构 建 ） 分 析 结 果 ， 常 常 用 到一 些 报 告 系 统 如 荧 光 蛋 白 ， 半 乳 糖 苷 酶 等 来 帮 助 检 测 。 后 者 也 称 稳 定 转 染 ， 外 源 DNA既可 以 整 合 到 宿 主 染 色 体 中 ， 也 可 能 作 为 一 种 游 离 体 （ episome） 存 在 。 尽 管 线 性 DNA比 超 螺旋 DNA转 入 量 低 但

34、 整 合 率 高 。 外 源 DNA 整 合 到 染 色 体 中 概 率 很 小 ， 大 约 1/104 转 染 细 胞 能 整合 ， 通 常 需 要 通 过 一 些 选 择 性 标 记 ， 如 来 氨 丙 基 转 移 酶 （ APH； 新 霉 素 抗 性 基 因 ） ， 潮 霉 素B 磷 酸 转 移 酶 （ HPH） ， 胸 苷 激 酶 （ TK） 等 反 复 筛 选 ， 得 到 稳 定 转 染 的 同 源 细 胞 系 。转 染 效 率 收 多 种 因 素 影 响 ， 主 要 因 素 有 下 面 几 个 ：1. 细 胞 培 养 物健 康 的 细 胞 培 养 物 是 成 功 转 染 的 基 础

35、 。 不 同 细 胞 有 不 同 的 培 养 基 ， 血 清 和 添 加 物 。 低 的细 胞 代 数 （ 50） 能 确 保 基 因 型 不 变 。 高 的 转 染 效 率 需 要 一 定 的 细 胞 密 度 ， 一 般 的 转 染 试 剂都 会 有 专 门 的 说 明 。 推 荐 在 转 染 前 24 小 时 分 细 胞 ， 这 将 提 供 正 常 细 胞 代 谢 ， 增 加 对 外 源 DNA摄 入 的 可 能 。 一 定 要 避 免 细 菌 ， 支 原 体 或 真 菌 的 污 染 。2. 血 清大 多 数 培 养 基 在 使 用 前 需 要 加 血 清 。 胎 牛 血 清 （ FCS）

36、 经 常 用 到 ， 便 宜 一 点 的 有 马 或 牛 血 清 。通 常 的 ， 血 清 是 一 种 包 含 生 长 因 子 及 其 它 辅 助 因 子 的 不 确 切 成 分 的 添 加 物 ， 对 不 同 细 胞 的 生长 作 用 有 很 大 的 差 别 。 血 清 质 量 的 变 化 直 接 影 响 转 染 效 率 。 因 此 在 转 染 前 建 议 先 测 (转 右 )试 出 对 细 胞 生 长 良 好 的 血 清 批 号 ， 转 染 时 用 同 一 批 号 的 血 清 ， 并 同 时 做 负 对 照 （ 不 加 转 染 试剂 及 外 源 DNA） 以 测 试 细 胞 生 长 是 否

37、 正 常 。 有 些 转 染 技 术 如 脂 质 体 转 染 在 有 血 清 存 在 情 况 下效 率 很 低 ， 因 此 在 转 染 前 要 除 血 清 。 但 有 些 对 此 敏 感 的 细 胞 如 原 代 细 胞 会 受 到 损 伤 ， 甚 至 死亡 导 致 转 染 效 率 极 低 。3. 载 体 构 建转 染 载 体 的 构 建 （ 病 毒 载 体 ， 质 粒 DNA， RNA， PCR 产 物 ， 寡 核 苷 酸 等 ） 也 影 响 转 染 结 果 。病 毒 载 体 对 特 定 宿 主 细 胞 感 染 效 率 较 高 ， 但 不 同 病 毒 载 体 有 其 特 定 的 宿 主 ， 有

38、 的 还 要 求 特 定的 细 胞 周 期 ， 如 逆 转 录 病 毒 需 侵 染 分 裂 期 的 宿 主 细 胞 ， 此 外 还 需 考 虑 一 些 安 全 问 题 （ 如 基 因污 染 ） 。 除 载 体 构 建 外 ， 载 体 的 形 态 及 大 小 对 转 染 效 率 也 有 不 同 的 影 响 ， 如 前 面 提 到 的 超 螺旋 及 线 性 DNA 对 瞬 时 和 稳 定 转 染 的 影 响 。 如 果 基 因 产 物 对 细 胞 有 毒 性 作 用 ， 转 染 也 很 难 进 行 ，因 此 选 择 组 成 或 可 调 控 ， 强 度 合 适 的 启 动 子 也 很 重 要 ， 同

39、 时 做 空 载 体 及 其 它 基 因 的 相 同 载 体构 建 的 转 染 正 对 照 可 排 除 毒 性 影 响 的 干 扰 。4. DNA 质 量DNA 质 量 对 转 染 效 率 影 响 非 常 大 。 一 般 的 转 染 技 术 （ 如 脂 质 体 等 ） 基 于 电 荷 吸 引 原 理 ，如 果 DNA 不 纯 ， 如 带 少 量 的 盐 离 子 ， 蛋 白 ， 代 谢 物 污 染 都 会 显 著 影 响 转 染 复 合 物 的 有 效 形 成及 转 染 的 进 行 。 核 酸 纯 化 世 界 第 一 品 牌 德 国 QIAGEN公 司 提 供 的 超 纯 质 粒 抽 提 试 剂

40、 盒 ， 能 达到 两 倍 2x CsCl梯 度 离 心 以 上 的 纯 度 效 果 ， 使 您 不 必 为 DNA 质 量 操 心 。 此 外 ， 对 一 些 内 毒 素敏 感 的 细 胞 （ 如 原 代 细 胞 ， 悬 浮 细 胞 和 造 血 细 胞 ） ， QIAGEN还 提 供 可 去 除 内 毒 素 污 染 的 质粒 抽 提 试 剂 盒 ， 在 质 粒 抽 提 过 程 中 有 效 去 除 脂 多 糖 分 子 ， 保 证 理 想 的 转 染 效 果 。5.转 染 技 术转 染 技 术 的 选 择 对 转 染 结 果 影 响 也 很 大 ， 许 多 转 染 方 法 需 要 优 化 DNA

41、 与 转 染 试 剂 比 例 ，细 胞 数 量 ， 培 养 及 检 测 时 间 等 。 一 些 传 统 的 转 染 技 术 ， 如 DEAE 右 旋 糖 苷 法 ， 磷 酸 钙 法 ， 电穿 孔 法 ， 脂 质 体 法 各 有 利 弊 ， 其 主 要 原 理 及 应 用 特 点 见 下 ：转 染 方 法 原 理 应 用 特 点DEAE-右 旋 糖 苷 法带 正 电 的 DEAE-右 旋 糖 苷 与 核 酸 带 负 电 的 磷 酸 骨 架 相 互 作 用 形 成 的 复 合 物 被 细 胞 内 吞 瞬 时性 转 染 相 对 简 便 、 结 果 可 重 复 但 对 细 胞 有 一 定 的 毒 副

42、作 用 ， 转 染 时 需 除 血 清磷 酸 钙 法磷 酸 钙 DNA复 合 物 吸 附 细 胞 膜 被 细 胞 内 吞 稳 定 转 染 ， 瞬 时 性 转 染 不 适 用 于 原 代 细 胞 ， 操 作简 便 但 重 复 性 差 ， 有 些 细 胞 不 适 用 。电 穿 孔 法高 脉 冲 电 压 破 坏 细 胞 膜 电 位 ， DNA 通 过 膜 上 形 成 的 小 孔 导 入 稳 定 转 染 ， 瞬 时 性 转 染 ， 所 有细 胞 适 用 性 广 但 细 胞 致 死 率 高 ， DNA和 细 胞 用 量 大 ， 需 根 据 不 同 细 胞 类 型 优 化 电 穿 孔 实 验条 件阳 离

43、子 性 的 脂 质 体 法带 正 电 的 脂 质 体 与 核 酸 带 负 电 的 磷 酸 基 团 形 成 复 合 物 被 细 胞 内 吞 稳 定 转 染 ， 瞬 时 性 转 染 ， 所有 细 胞 适 用 性 广 ， 转 染 效 率 高 ， 重 复 性 好 但 转 染 时 需 除 血 清转 染 效 果 随 细 胞 类 型 变 化 大病 毒 介 导 法逆 转 录 病 毒 通 过 侵 染 宿 主 细 胞 将 外 源 基 因 整 合 到 染 色 体 中 稳 定 转 染 ， 特 定 宿 主 细 胞 可 用 于难 转 染 的 细 胞 、 原 代 细 胞 ， 体 内 细 胞 等 ， 但 携 带 基 因 不

44、能 太 大细 胞 需 处 分 裂 期 ， 需 考 虑 安 全 因 素 ， 腺 病 毒 瞬 时 转 染 ， 特 定 宿 主 细 胞 可 用 于 难 转 染 的 细胞 ， 需 考 虑 安 全 因 素 。Biolistic 颗 粒 传 递 法将 DNA用 显 微 重 金 属 颗 粒 沉 淀 ， 再 将 包 被 好 的 颗 粒 用 弹 道 装 置 投 射 入 细 胞 ， DNA 在 胞 内 逐 步释 放 ， 表 达 瞬 时 性 转 染 可 用 于 ： 人 的 表 皮 细 胞 ， 纤 维 原 细 胞 ， 淋 巴 细 胞 系 以 及 原 代 细 胞显 微 注 射 法用 显 微 操 作 将 DNA 直 接 注 入 靶 细 胞 核 稳 定 转 染 ， 瞬 时 性 转 染 转 染 细 胞 数 有 限 ， 多 用 于 工 程改 造 或 转 基 因 动 物 的 胚 胎 细 胞