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类型基因诊断.doc

  • 上传人:cjc2202537
  • 文档编号:5558699
  • 上传时间:2019-03-07
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    基因诊断.doc
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    1、第九章 基因诊断基因诊断是通过检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。基因诊断的主要技术:1、核酸分子杂交2、聚合酶链反应(PCR)3、基因芯片技术第一节 核酸分子杂交技术核酸杂交(Nucleic acid hybridization)是指具有一定同源性的两条单链核酸在一定条件下,按碱基互补的原则重新配对形成双链的过程。一、核酸杂交的基本原理DNA 的变性和复性:在一定的条件(如适当的温度、有机溶剂存在等)下,DNA 的双链可解开成为单链,这一过程称为 DNA 的变性(Denaturatioin) 。高温、低盐和有机溶剂促进 DNA 变性。Tm 值是反映 DNA 的热稳定性的一个参数,称

    2、为 DNA 的熔化温度,系指一半的双链 DNA 解离成为单链时的温度。DNA 的热稳定性或 Tm 值直接与其碱基组成特别是 GC 碱基对含量有关,GC 碱基对含量越高,Tm 值也越高。DNA 的杂交即复性(Renaturation)是变性的单链 DNA 在一定的条件下(低于 Tm 的温度下)与其互补序列退火形成双链的过程,因此杂交与 Tm 值相关。影响杂交的主要因素:温度:一般在低于 Tm 约 15 至度的温度下杂交速率最快。盐浓度:钠离子增加杂交分子的稳定性,降低钠离子浓度强烈地影响 Tm值和复性速率。但当钠离子浓度超过 0.4M 时,对复性速度和 Tm 值影响不大。甲酰胺:有机溶剂如甲酰胺

    3、能减少双链核酸的稳定性。每增加 1%的甲酰胺,DNA/DNA 或 DNA/RNA 双链的 Tm 值减少 0.72。常用 50%甲酰胺硫酸葡聚糖:使杂交速率增加,但有时可能增加杂交本底。二、核酸探针的选择和标记核酸探针是指能与待检测的靶核酸序列互补杂交的某种已知核酸片段,它必须具有高度的特异性,并且带有某种适当的标记以便被检测。(一)核酸探针的类型1、克隆的 DNA 片段,常用 cDNA 探针。2、RNA 探针(Riboprobe)RNA 探针的优点是特异性高;杂交效率(灵敏度)更高。适合于 Northen 杂交、原位杂交等。主要缺点是不稳定,易被降解,另外其制备较困难。3、寡核苷酸探针 可用化

    4、学方法人工合成,制备较方便,但灵敏度稍差。4、聚合酶链反应扩增产物 是很好的探针来源,其优点是制备和标记相对容易。(二)核酸标记的类型放射性同位素 目前应用最广,优点是灵敏度高,特别适用于单拷贝基因或低丰度 mRNA 检测,缺点是易造成放射性污染以及半衰期短,使用不便。核酸探针标记常用的同位素有以下几种:、 P:其放射性强,自显影时间短,灵敏度较高,缺点是半衰期短(14.3天) ,放射线散射较严重,因此对分辩率有影响。、 35S :放射性较低,半衰期长(87.1 天) ,灵敏度较高;低散射,因此在用光片自显影时分辩率高,特别适用于核酸序列分析和原位杂交等实验。、 33P :是一种较理想的同位素

    5、,它的放射性较低,灵敏度高,分辩率好,半衰期也较长(25.4 天),适用范围较广。但价格偏高。非同位素标记:常用地高辛或生物素系统。优点:无放射性污染,较稳定;缺点:灵敏度、特异性稍差。(三)核酸探针的标记1、随机引物法(Random priming)随机引物是人工合成的含有各种可能的排列顺序的六核苷酸片段的混合物,因此可以与任何核酸片段杂交,并作为聚合酶反应的引物。标记酶:大肠杆菌 DNA 聚合酶的大片段klenow 片段。特点:所得探针的放射性比活较高,适用于大多数杂交。2、缺刻平移法(Nick translation0标记酶:大肠杆菌 DNase(极微量)和 DNA 聚合酶。用缺刻平移法

    6、制备的探针较短,较适合于原位杂交。3、RNA 探针的制备和标记RNA 探针可用 RNA 聚合酶体外转录法制备。该方法的合成效率高,所得产物大小均一,有较高的比活,特异适合于 Northern 杂交和原位杂交。4、聚合酶链反应标记 DNA 探针利用 Taq DNA 聚合酶和标记的 dNTP,sk 以少量的起始模板合成高比活的 c双链或单链 DNA 探针。5、寡核苷酸探针的标记5-端标记:T4 多核苷酸激酶标记法,一般用于制备 DNA 序列分析时用的5-标记的寡苷酸引物。3-端标记:末端转移酶法, 32P-dNTP 或 ddNTP。6、非同位素核酸探针标记:地高辛或生物素标记的核酸探针的制备方法和

    7、同位素探针相似。但是不能用多核苷酸激酶标记法直接对 5-端进行非同位素标记。三、常用核酸杂交技术滤膜杂交固相杂交 核酸杂交 原位杂交液相杂交滤膜杂交是指先将待检测的核酸序列结合到适当的固相支持物如尼龙膜上,然后与存在于溶液中的已标记探针进行杂交的过程。滤膜杂交的基本过程为:1、核酸探针的制备和标记;2、核酸片段的凝胶电泳分离;3、将凝胶中的核酸片段通过印迹(blot)转移到某种固相支持物上;4、用标记的探针与被固定的靶核酸序列杂交(通过还包括预杂交) ;5、洗膜(除去未杂交的游离探针等) ;6、检测带标记的杂交分子(放射自显影或酶联反应) 。(一)斑点狭缝印迹(Dot/slot blot)杂交

    8、:DNA 或 RNA 样品经变性后直接点样于尼龙膜上,然后进行杂交和检测。其优点是简单、迅速,可同时做多个样品;缺点是特异性不好,有一定比例的假阳性,此外,靶核酸的分子大小难于判断。(二)Southern 印迹:指将经过电泳分离的 DNA 片断转移到一定的固相支持物的过程。Southern 印迹杂交的步骤如下:1、用限制性内切酶消化大分子 DNA;2、用琼脂糖凝胶电泳对 DNAa 片段按分子量大小分离;3、将 DNA 片段在琼脂糖凝胶电泳中变性成单链后,再转移到适当的固相支持物上并与之结合;、 探针与膜上的 DNA 杂交;、 检测。Southern 印迹杂交主要用于基因组结构分析、基因组 DN

    9、A 的定性和定量分析以及利用限制性片段长度多态性进行基因突变分析等。(三)Northern 印迹:是指 RNA 经变性凝胶电泳后,将其转移到固相支持物上,以便用杂交反应检测特定的 mRNA 分子的含量与大小。是基因表达研究分析的标准方法。Nothern 印迹的基本过程包括:1、RNA 的提取;2、RNA 变性电泳;3、RNA 转移和固定;4、杂交;5、检测。除 RNA 的提取和变性胶电泳与 DNA 不同外,其余基本与 Southern 印迹相同,关键是减少实验中的 RNA 酶污染。(四)核酸杂交在基因诊断中的应用通过核酸杂交技术,可以利用带有某种标记的已知核酸片段作为探针,去检测未知核酸序列。

    10、因此,核酸杂交可用于基因鉴定和基因突变分析等领域。1、限制性片段长度多态性(RFLP)分析 多态性(polymorphism)指基因组中特定基因座位(DNA 序列)存在两种或两种以上状态(等位基因) ,并且其中任何一个等位基因在人群中的频率不低于 1%。限制性片段长度多态性(RFLP)是由于 DNA 变异(产生新的酶切位点或消除原有的酶切位点)导致在限制性核酸内切酶酶切时产生不同长度的片段。可借助 southern blotting 或 PCR 的方法进行检测RFLP 分析与遗传病基因诊断。人类染色体 VNTR 序列的 RFLP 分析图谱:DNA fingerprinting。2、等位基因特异

    11、性寡核苷酸(ASO)探针杂交寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性,因此可用人工合成的针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交,检测点突变。3、基因表达分析 常用 Northern blotting 或原位杂交分析。第二节 聚合酶链反应(PCR)技术一、PCR 的基本原理(一)PCR 的基本过程PCR 是一种体外扩增特异 DNA 片段的技术。它包括下列三个基本步骤:1、变性(Denaturation ):待扩增的 DNA 模板加热变性成单链;2、退火(Annealing):降低温度,使单链靶序列与寡核苷酸引物退火;3、延伸(Extension):在适当条件下,利用 DNA 聚

    12、合酶使引物延伸,产生新的双链。上述变性、退火、延伸步骤的重复循环,导致特异的靶序列的指数扩增。PCR 产物是介于引物的 5端之间的双链 DNA 片段。(二)PCR 体系中的主要成份1、Taq DNA 聚合酶 是一种耐热的 DNA 聚合酶,具有 5-3DNA 聚合酶活性,一般有 5-3 外切酶活性,有或无 3-5外切酶活性(校对活性) ,无校对活性的酶在 PCR 中错掺率较高。PCR 中 Taq 酶的用量一般为 0.5-2.5U,过多易造成非特异性扩增,过少可能灵敏度不够。2、寡核苷酸引物 是决定 PCR 扩增特异性的关键。设计 PCR 引物时的几条原则: 引物长度一般 15-30 碱基,过短则

    13、特异性低; 避免内部二级结构; G/C 和 A/T 碱基均匀分布,G/C 含量在 45%-55% 之间; 两个引物(特别是 3端)间不能发生互补,以免形成引物引物二聚体; 引物的 3-端碱基一般应与模板严格配对,并且 3端为 G、C 或 T 时引发效率较高; 引物的 5-端可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别位点、ATG起始密码子或启动子序列等)PCR 中所用引物浓度一般在 0.1-0.5uM 太高的引物浓度易造成非特异性扩增,太低会降低合成效率。3、MgCl2 Mg2+浓度除影响 Taq 酶活性外,还影响双链 DNA 的 Tm 值,因而影响PCR 的特异性和扩增效率。PCR 中的最适

    14、 MgCl2 浓度一般为 1.5-2.5mM(注意游离 Mg2+浓度还与能结合Mg2+的化合物如 dNTP、EDTA 等的浓度有关。4、脱氧核苷三磷酸(dNTP)一般采用均衡的 dNTP 浓度,4 种 dNTP 各为 200umol/L,dNTP 可减少游离 Mg2+,因此影响聚合酶活性和引物退火。5、模板 单、双链 DNA,以及 RNA 经逆转录合成的 cDNA。PCR 样品可以是粗制品,但不应含有核酸酶和蛋白酶及其它干扰 Taq 酶活性的抑制剂 。引物/模板的比率影响 PCR 的特异性。(三)PCR 循环参数1、预变性(Initial denaturation) 模板 DNA 完全变性对

    15、PCR 能否成功至关重要,一般 95加热 3-5 分钟。2、引物退火(Primer annealing)退火温度一般需要凭实验(经验)决定。退火温度对 PCR 的特异性有较大影响。3、引物延伸引物延伸一般在 72进行(Taq 酶最适温度) 。延伸时间随扩增片段长短而定。4、循环中的变性步骤循环中一般 95,30 秒足以使各种靶 DNA 序列完全变性:变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。5、循环数大多数 PCR 含 25-35 循环,过多易产生非特异扩增。6、最后延伸在最后一个循环后,反应在 72维持 5-15 分钟使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链。(四)PCR

    16、中的污染和假阳性PCR 中污染主要来自1、样品间交叉污染;2、先前 PCR 产物遗留(carry-over)二、几种常用特殊 PCR 技术(一)逆转录 PCR(Reverse transcription PCR,RT-PCR)RNA 经逆转录后可作为 PCR 的模板.逆转录 PCR(RTPCR)常用于基因表达研究(定量 PCR)和逆病毒检测设计 RTPCR 引物时,应使引物分别位于不同的外显子中,以便区别cDNA 和 gDNA 扩增产物。(二)多重 PCR(Multiple PCR )在同一 PCR 反应体系中用多对引物(覆盖不同长度的靶序列)同时扩增。例如用多重 PCR 进行 DNA 缺失筛

    17、选(三) 套式 PCR(nested PCR)用第一次 PCR 扩增区域内部的第二对(套式)引物对第一次 PCR 产物再次扩增,可以增加特异性和灵敏度。(四)非对称 PCR(asymmetric PCR)在 PCR 反应体系中,限制引物之一的浓度(50100:1)进行扩增,可得到单链 PCR 产物,可用于制备单链测序模板或单链 DNA 杂交探针。三、PCR 与突变检测通过 PCR 扩增片段的多态性分析有助于检测各种突变。PCR 扩增产物的多态性可分为三种类型:1、限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism-RFLP );2、序列多态性

    18、(Sequence polymorphism);3、长度多态性(Length polymorphism)(一)PCR-RFLP 分析设计适当的扩增引物,使扩增片段包括某一或数个多态性的限制性内切酶识别序列,在 PCR 扩增后用该限制酶切割 PCR 产物,根据电泳后酶切片段长度变化,即可作出诊断,该方法主要用于检测各种已知突变。(二)PCR 结合 ASO 探针杂交分析ASO(Allele specific oligonucleotide)探针:等位基因特异性寡核苷酸探针,指针对各种正常和突变靶序列设计的特异性寡核苷酸探针。1、PCR 产物变性后斑点印迹至膜上,用一系列 AS0 探针杂交,严格控制

    19、杂交和洗膜条件、确保正常 ASO 探针只与正常靶序列条交,而突变 ASO 只与含相应突变碱基的靶序列杂交。2、另一种方法是将 ASO 探针固定在膜上,然后与生物素标记的 PCR 产物杂交-反向斑点杂交(reverse dotblot ) ,这样一次杂交可完成多个探针检测。上述方法适用于基因组中某些固定位点上的已知序列差异的检测,如癌细胞中的 ras 突变,HLA typing 等。(三)等位基因特异性扩增(A11eles specific amplification,ASA )-又称扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system,ARMS)利

    20、用PCR引物的3端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,设计等位基因特异性 PCR扩增引物,在严格的条件下,只有在引物3碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带,从而检测出突变,该法省去了探针杂交操作。(四)PCR-SSCP分析单链DNA在中性条件下,由于碱基配对等分子内相互作用而具有复杂的折叠构象,在聚丙烯酰胺凝胶电泳中,其迁移率除与长度有关外,还与其构象有关。DNA的突变造成DNA片段中碱基序列不同,变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的构象不同单链构象多态性(Single strand conformation polymorphism,SSCP),利用迁移率的差别可使各种序列不同

    21、的单链得以分离。PCR一SSCP的步骤:PCR扩增产物热变性成单链非变性PAGE显示(放射自显影或银染等)PCRSSCP 是检测点突变的简便灵敏方法,已用于多种遗传病、肿瘤中原癌基因和抑癌基因的突变分析,对200bp 片段其灵敏度较好,靶序列增长时其灵敏度下降(一般 175-345nt)。(五)扩增片段长度多态性(Amp-FLP)VNTR、STR 等重复序列,因重复单位数目的不同而呈现高度多态。因此利用重复序列两侧的特异性引物进行 PCR 扩增,所得扩增片段具有高度多态性,这些不同长度的等位片段可用 PAGE 分离。(六)PCR 直接测序DNA 序列分析是检测基因突变最直接最可信的方法,它不仅

    22、可确定突变的部位,还可确定突变的性质。PCR 直接测序是指对 PCR 产物直接进行序列分析,而不是先将 DNA 待测片段克隆于测序载体上,这可大大的简化操作步骤。PCR 产物测序常采用循环测序法(cycle sequencing):在 PCR 反应体系中同时将 ddNTP 加入,并利用同位素或荧光素标记的引物引导扩增,使模板的扩增与测序同时进行。应用 PCR 测序有以下优点:模板需要量小;方法简便,易自动化;测序效率高。四、PCR 在基因诊断中的应用(一)遗传病的基因诊断目前已有近百种遗传病可用 PCR 技术进行诊断和产前诊断。用 PCR 对遗传病进行诊断的前提是对致病基因的结构必须部分或全部

    23、清楚。.如利用 PCR-RFLP 或 Amp-FLP 对遗传病家系进行连锁分析,进而作出基因诊断。(二)传染病诊断PCR 已应用于多种病原体的特异性检测和鉴定1、病毒:如 HBV,HCV,HIV,HPV 等。2、致病菌:如淋球菌、结核杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、肺炎支原体等;(三)肿瘤基因诊断1、原癌基因和抑癌基因突变,如ras,p53;癌基因扩增和表达分析。2、利用微卫星不稳定性,直接诊断肿瘤,如膀胱癌等;3、分析白血病(如CML)中异常染色体易位,检测微小残留病变(Minimal residual disease,MDR)4、肿瘤多药耐药性(multi-drug resistance,MDR

    24、 )检测5、端粒酶活性检测第三节 基因芯片技术基因芯片(Gene chip/DNA chip)又称为 DNA 微矩阵(DNA Microarray) ,是包被在固相载体上的高密度 DNA 的微阵列。一、基因芯片的类型:1、寡核苷酸芯片:采用固相原位合成技术制备的,或用传统方法合成后再固定于芯片上的寡核苷酸探针阵列(Genechip, Affymatrix,Inc) 。2、DNA 微矩阵(DNA Microarray):将 DNA 探针通过自动化点样技术固定于特定的固相支持物如玻璃表面,然后再与靶序列杂交。二、基因芯片技术的原理DNA 芯片技术是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列固定

    25、于支持物(如膜、硅片或玻璃片)上,然后通过类似核酸杂交的的方法与待测的标记样品按碱基配对原则进行杂交,再通过检测系统对其进行扫描,并用相应软件对信号进行比较和检测,得到所需的生物信息。其特点是可进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。用 DNA 微矩阵进行基因表达分析的步骤1、分离(待比较的)不同组织或细胞的 mRNA,逆转录法制备带不同荧光标记的cDNA 探针;2、混合探针,并与 microarray 杂交,洗涤除去未结合探针。3、用特有波长的激光扫描芯片,并用共聚焦显微镜检测各探针的荧光,各element 的相对荧光强度反映特异 mRNA 的相对丰度。三、基因芯片技术

    26、的应用1、疾病诊断(遗传病、肿瘤和病原体诊断)2、新药筛选和毒理学研究3、突变/多态性检测单核苷酸的多态性( single nucleotide polymorphism, SNP)。4、基因表达分析5、发现新基因四、表达谱基因芯片的特点及其应用利用基因芯片可进行高通量基因表达平行分析,是基因功能研究的重要手段。对来源于不同个体(正常人与患者) 、不同组织、不同细胞周期、不同发育和分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗阶段)下的细胞内的mRNA 或逆转录后产生的 cDNA 与表达谱基因芯片进行杂交,可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特

    27、异性、刺激特异性进行综合的分析和判断,迅速将某个或几个基因与疾病联系起来,极大地加快这些基因功能的确立,同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的 Northern Blot 相比有许多重要的优点:1、检测系统的微型化,对样品等需要量非常小 2、同时研究上万个基因的表达变化,研究效率明显提高 3、能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系,从而研究基因与基因之间内在的作用关系 4、检测基因表达变化的灵敏度高,可检测丰度相差几个数量级的表达情况 5、节约费用和时间 Further Readings1. Ekins R. and Chu F.W. Microarr

    28、ays: their origins and applications. Trends in Biotechnolology, 1999, 17, 217-218. 2. Sinclair, B. Everythings Great When It Sits on a Chip - A bright future for DNA arrays, The Scientist, 1999 May 24, 13(11), 18-20. 3. Nature Genetics published a special issue (January 1999 Supplement), The Chippin

    29、g Forecast. Its a collection of more than 10 reviews (60 pages) on different aspects of microarray analysis. All the reviews are freely available online. 4. Schena, M., Heller, R.A., Theriault, T.P., Konrad, K., Lachenmeier, E., and Davis, R.W. Microarrays: biotechnologys discovery platform for func

    30、tional genomics. Trends in Biotechnology 1998, 16, 301-306. 5. Service, R.F. Microchip arrays put DNA on the spot. Science 1998, 282(5388), 396-399. 6. Ramsay, G. DNA chips - states-of-the-art. Nature Biotechnology 1998, 16(1), 40-44. 7. Marshall, A.; Hodgson, J. DNA chips - an array of possibilities. Nature Biotechnology 1998, 16(1), 27-31.

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