1、申请代码： C140303受理部门： 收件日期：受理编号：解 除 保 护国家自然科学基金申 请 书(2008 版 ) 资助类别：面上项目亚类说明： 附注说明： 项目名称：血红素加氧酶-1 介导 Th17 细胞在哮喘气道炎症中的免疫调节作用申 请 者：夏振炜 电话： 021-64333414 依托单位：上海交通大学 通讯地址：上海市卢湾区瑞金二路 197 号 邮政编码：200025 单位电话：021-34206809 转 82 电子邮件： 申报日期： 2008 年 1 月 25 日国家自然科学基金委员会国家自然科学基金申请书 2008 版第 2 页 版本 1.003.381基本信息 ykKr4o
2、HP姓名 夏 振 炜 性别 男 出生年月 1963 年 7 月 民族 汉族学位 博士 职称 研究员 主要研究领域 气道炎症免疫调节 电话 021-64333414 电子邮件 传真 个人网页 工作单位 上海交通大学 /医学院附属瑞金医院申 请 者 信 息在研项目批准号 30570798 名称 上 海 交 通 大 学 代 码 20003001 联系人 张艳 电子邮件 jhk- 依托单位信息电话 021-34206809 转 82 网站地址 单 位 名 称 代 码Oregon Health and Science University 00000000 合作单位信息在 此 录 入 修 改 项目名
3、称 血 红 素 加 氧 酶 -1介 导 Th17细 胞 在 哮 喘 气 道 炎 症 中 的 免 疫 调 节 作 用资助类别 面上项目 亚类说明 附注说明 申请代码 C140303:炎症 C1705:儿科学基地类别 预计研究年限 2009 年 1 月 2011 年 12 月 研究属性 应用基础研究 项 目 基 本 信 息申请经费 34.0000 万元摘 要(限 400 字)：目前认为支气管哮喘是以 Th2 分泌的细胞因子所致炎性细胞浸润为主的慢性气道炎症。近年研究发现，一类新的 Th 细胞亚群-Th17，具有调控 Th1 和 Th2 的作用。Th17 主要分泌 IL-17，迄今发现有 6 种亚型
4、（IL-17A-F） 。在哮喘气道炎症中，IL-17A/F可促发中性粒细胞性炎症，而 IL-17E 能促进 Th2 反应，诱导并激发嗜酸性粒细胞性慢性炎症，但具体机制尚未阐明。血红素加氧酶-1（HO-1）是血红素代谢的限速酶，作为保护蛋白，具有抗氧化应激和抗炎作用。课题组最近研究表明 HO-1 高表达后可明显减轻气道炎症和气道高反应性；预实验显示：经血红素诱导 HO-1 表达可影响 IL-17 分泌。因此本课题设想通过 Th17 培养和构建小鼠哮喘模型，分析血红素干预前后 Th17 及其分泌的细胞因子 IL-17 变化，探讨 HO-1、Th17 和哮喘三者关系，阐明 HO-1 抗炎作用机制并提
5、供临床防治新思路。关 键 词(用分号分开，最多 5 个) 血红素加氧酶-1；Th17；白介素-17；哮喘；炎症 国家自然科学基金申请书 2008 版第 3 页 版本 1.003.381项目组主要成 员 （注: 项目组主要成员不包括项目申请者，国家杰出青年科学基金类项目不填写此栏。 ）编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工每年工作时间（月）1张 自 力 1964-02-01 男 副教授 博士 Oregon Health and Science University （53）494-8188 zhangziohsu.edu 课题设计实验指导 4 2钟 文
6、伟 1974-12-08 男 主治医师 硕士 上海交通大学 021-64370045 细胞培养细胞因子测定 4 3苏 雯 1983-03-12 女 博士生 学士 上海交通大学 021-64370045 动物造模细胞因子测定 8 4王 慧 英 1982-09-15 女 硕士生 学士 上海交通大学 021-64370045 细胞鉴定与功能检测 8 5须 丽 清 1977-06-01 男 博士生 硕士 上海交通大学 021-64370045 细胞培养因子测定 6 6李 春 娥 1978-09-09 女 主治医师 硕士 上海交通大学 021-64370045 实验指导 4 7崔 贻 芬 19
7、57-05-29 女 技师 其他 上海交通大学 021-64370045 细胞培养 6 8在 此 录 入 修 改 9 在 此 录 入 修 改 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生8 2 2 1 0 2 1说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报（含申请者） ，总人数自动生成。国家自然科学基金申请书 2008 版第 4 页 版本 1.003.381经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一.研究经费 25.9 1.科研业务费 7.9 （1）测试/计算/分析费 3.0000 Western blot、ELISA、Real-Ti
8、me PCR 等测试（2）能源/动力费 1.7000 水、电、煤费用，按 5%计（3）会议费/差旅费 2.0000 参加国际、国内会议（4）出版物/文献/信息传播费 1.2000 文献检索、论著发表费（5）其它 2.实验材料费 18 （1）原材料/试剂/药品购置费 18.0000 质粒构建，T 细胞分离纯化柱、分离 Kit、试剂盒、Balb/C 和 DO11.10 小鼠（2）其它 3.仪器设备费 0 （1）购置 （2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 二.国际合作与交流费 3 1.项目组成员出国合作交流 2.境外专家来华合作交流 3.0000 邀请协作者来华交流路费和住宿费三.劳务费 3.4
9、000 研究生劳务费四.管理费 1.7000 组织实施费，按 5%计合 计 34 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 5.0000与本项目相关的 其他经费来源其他经费来源合计 5国家自然科学基金申请书 2008 版第 5 页 版本 1.003.381报告正文查 看 报 告 正 文 撰 写 提 纲（一）立项依据与研究内容：1. 项目的立项依据支气管哮喘是最常见的呼吸道慢性炎症性疾病之一，随着生活水平不断提高及生活方式西方化，该病呈不断上升趋势，成为危害人类身体健康的主要疾病之一，给社会带来巨大的经济负担。支气管哮喘因长期、反复慢性炎症可导致气道重塑，严重影响肺功能，因此阐明其发病机
10、制并早期、有效的控制哮喘气道炎症是临床与科研丞待解决的问题。支气管哮喘发病机制十分复杂，涉及肺组织中抗原递呈细胞、树突状细胞、T辅助细胞（T help cells, Th）和调节性T淋巴细胞（regulatory T cells, Treg）及其相互作用。目前认为过敏原促进初始Th0细胞向抗原特异性Th2细胞定向分化，建立以Th2细胞占优势的T 细胞免疫应答反应，导致Th1/Th2比例失衡。Th2 分泌细胞因子如白介素（interleukin, IL）-4、-5 和-13等，一方面进一步促进Th0细胞向Th2细胞分化，另一方面作用于B 淋巴细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞（eosinophil,
11、EOS） ，诱发以EOS浸润为主的慢性气道炎症和气道高反应性（哮喘的两个重要特征）。在慢性气道炎症的基础上，又因过敏原暴露及感染等诱因导致中性粒细胞和单核细胞在肺部大量募集，产生大量氧自由基，引起哮喘急性加重 1-3。而哮喘的反复急性发作和气道慢性炎症持续状态则导致气道结构破坏与修复交替反复，引起平滑肌增生，最终导致气道重塑。但研究发现，一类新的Th细胞亚群 Th17细胞，在哮喘气道炎症的发生发展中起重要作用。Th17细胞是新近提出的一类独立的 Th细胞亚群，不同于Th1 （分泌IFN-和TNF-）和Th2 （分泌IL-4、IL-5 和IL-13 ）细胞，因分泌IL-17而命名，又称为产生IL
12、-17 的效应性T 淋巴细胞（IL-17 producing effector T cells）。该类细胞分泌的细胞因子能够趋化中性粒细胞、单核细胞等，促进炎症的发生，在自身免疫性疾病中起着主导作用，故成为目前研究的热点 4-6。关于Th17细胞的起源、分化尚未明确，目前认为 Th17起源于初始Th0 细胞，在TGF-、IL-6的协同作用下分化为Th17细胞 7-9， 其中IL-23对维持并扩增该细胞亚群具有重要作用，而IL-4和IFN- 协同作用可抑制Th17分化 4（图1），新近研究表明IL-27亦可抑制 Th17分化 10。国家自然科学基金申请书 2008 版第 6 页 版本 1.003
13、.381图 1 Th17 细胞分化示意图Th17细胞以CD4 + T细胞为主， 又称为细胞毒性T细胞抗原8（CTLA-8） 11，主要通过分泌IL-17发挥作用 4，其中人IL-17为同源二聚体蛋白，其氨基酸序列与松鼠猴疱疹病毒的开放阅读框（HSVS13）有58 %的同源性。迄今IL-17 家族已发现6种亚型（IL-17A-F） ，分泌的IL-17由2个32 kDa同源二聚体构成。Th17细胞分泌的IL-17 主要为IL-17A和IL-17F（IL-17A/F） 。体内IL-17通过与细胞膜上 IL-17受体（IL-17R）结合而发挥作用。IL-17R 是一种 型跨膜蛋白，含864 个氨基酸，
14、在气道上皮细胞、人表皮成纤维细胞、人胚肾细胞、B细胞、髓单核细胞、CD56 +外周血NK细胞、外周血单个核细胞上均有表达，而IL-17A/F主要与IL-17RA受体结合 4,12，可激活3条经典MAP 激酶信号传导途径，包括ERK1、ERK2、JNK和P38，引起IL-6和IL-8 的分泌，从而导致中性粒细胞在局部的募集，包括浸润气道引发哮喘。IL-17还可触发NF-B，导致T 细胞增殖，并上调众多炎症介质基因如NOS和IL-1等的表达，亦可促进粒细胞生成因子分泌，导致骨髓、脾脏中粒细胞数量增加 4,12-14。因而在众多炎症如哮喘、炎症性肠病、类风湿性关节炎及实验性自身免疫性脑炎等，IL-1
15、7表达显著升高 15。进一步研究发现，先前认为由Th1细胞造成的免疫性疾病实际由 IL-17所致，而且 IL-17在过敏性疾病中的作用亦逐渐被认识。因此，IL-17在哮喘中的作用愈来愈受到重视。一方面， IL-17可协同趋化中性粒细国家自然科学基金申请书 2008 版第 7 页 版本 1.003.381胞和单核细胞募集的细胞因子IL-8、GRO、GCP-2和刺激骨髓粒细胞增生的细胞因子IL-6、GSF、GM-CSF和诱导单核细胞的 IL-1和TNF-等作用，促进中性粒细胞、单核细胞生成并在肺部募集，增强其功能和生存时间，引起肺部炎症（图2） 。研究发现在图 2 Th17 细胞在气道炎症中的作用
16、哮喘急性发作和哮喘职业病，中性粒细胞起了重要作用。因而认为IL-17A/F参与了以中性粒细胞浸润为主的哮喘发生 1,3。在过敏性哮喘动物模型中，Naruhito等 16采用分子克隆技术，体外构建小鼠pcDNAmIL-17F 质粒，并将其导入OVA 致敏小鼠肺组织中，结果发现在OVA激发后支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）内中性粒细胞和单核细胞显著增加，小鼠对乙酰胆碱的气道反应性明显增高，粘蛋白基因表达增强；Peter等 17对 OVA致敏小鼠经IL-17抗体干预后发现 BALF内中性粒细胞显著减少，提示IL-17A/F参与了由过敏原诱导
17、的气道高反应性。但IL-17A/F对引起气道慢性炎症的主要炎症细胞EOS则具有相反的作用。研究发现，通过质粒转染诱导 IL-17基因在局部高表达或局部给予重组IL-17蛋白后，随着中性粒细胞的增加， EOS并未增加甚至减少，而给予IL-17单克隆抗体后随着局部中性粒细胞的减少， BALF及骨髓中EOS却显著增加，血清及BALF中IL-5显著升高 15-17。最新研究报道：IL-17E能促进Th2反应，诱导并激发EOS性慢性炎症，因此IL-17E与以EOS浸润为主的气道炎症和气道高反应性密切相关，但Th17是否分泌IL-17E 有待进一步明确。在过敏性哮喘患者和动物模型的血、痰液和BALF中，I
18、L-17 mRNA与蛋白含量均显著升高。Silvia等 18采用IL-17R基因剔除小鼠建立哮喘模型，发现IL-17R 缺陷小鼠气道炎症明显减轻，BALF 中 EOS减少，血清抗原特异性IgE 水平降低，体外肠系膜淋巴国家自然科学基金申请书 2008 版第 8 页 版本 1.003.381细胞培养并经特异性抗原刺激后IL-5产生减少，提示 IL-17又与哮喘严重程度呈正相关15-19。血红素加氧酶（heme oxygenase, HO）是哺乳动物和人体内血红素代谢途径中的限速酶，将血红素四吡咯环上的甲基桥裂解，最终形成等量的胆绿素及CO并释放铁原子。随之，胆绿素经胆绿素还原酶作用形成胆红素。目
19、前发现HO有三种同工酶，为不同基因产物：即诱导型HO-1，组成型HO-2及新近发现的异构体HO-3。三种同工酶的氨基酸序列和诱导性各异，但具有共同的催化底物反应机制和反应产物。HO-1分子量为33 kDa，由 288个氨基酸构成，为热休克蛋白32（HSP32）。血红素，金属元素，氧化应激，紫外照射，化合物，高温，某类药物，还原型谷胱甘肽等均能诱导HO-1，分布在肝脏、脾脏、肺脏等组织。HO-2由361个氨基酸构成，分子量为36 kDa，HO-2不受外因诱导，在脑和睾丸中浓度最高。HO-3是一个约2.4 kb的单一转录产物，分子量约33 kDa，分布在脾脏、肝脏、胸腺、前列腺、心脏、肾脏、大脑和
20、睾丸组织中。HO-3类似于HO-2，但催化活性极低。与HO-1、HO-2 相比， HO-3代谢血红素的能力较弱，推测可能对血红素依赖性的反应过程有调节作用。至今HO-3生理功能尚未明确，相关的研究报道亦甚少。大量基础和临床实验证明HO-1作为保护蛋白，表达后具有抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡和抗平滑肌增生等重要功能 20-24，在许多疾病如支气管哮喘 22-24等中发挥其保护作用，其在多种疾病中的潜在治疗意义也越来越受到重视 25,26。新近研究发现HO-1抗哮喘气道炎症作用主要表现为：减少炎症细胞在局部的浸润。研究表明，上调HO-1表达可以抑制单核细胞浸润。 抑制促炎因子如TNF- 、IL-1
21、 、MIP-1、GM-CSF的产生 27,28。此类因子相互作用，募集众多炎性细胞，进而又促使各种炎性介质、细胞因子释放，使气道炎症加剧，触发并放大炎症效应；而HO-1通过抑制前炎症因子释放从而阻断这一重要环节，起到抗炎作用。促进抗炎细胞因子 IL-10的释放，抑制Th2细胞因子的分泌和IgE的产生，促进EOS凋亡和减轻抗体介导的EOS炎症 29。稳定肥大细胞，抑制肥大细胞脱颗粒及白细胞粘附于血管内皮上。抑制粘附分子在血管内皮细胞上的表达。Almolki发现在卵清蛋白（ ovalbumin, OVA）诱导的豚鼠哮喘模型经血红素（hemin）上调HO-1基因表达则明显减轻气道炎症反应；反之，用
22、HO-1抑制剂锡- 原卟啉（ Sn-protoporphyrin, SnPP）后则逆转该反应 22。另有报道显示HO-1和CO能抑制平滑肌增生，阻止气道重塑。但HO-1通过何种细胞发挥免疫调节作用至今未见确切的报道。国家自然科学基金申请书 2008 版第 9 页 版本 1.003.381课题组近期的研究结果显示：在 OVA 致敏、激发的哮喘小鼠，经 Hemin 上调HO-1 表达后，肺脏和脾脏中 foxp3 表达及蛋白量增加，血清 IL-10 增高，而 OVA 特异性 IgE 水平降低，肺脏病理组织学检测、BALF 中细胞总数和 EOS 计数均显示炎性细胞尤其是 EOS 浸润减少；CD4 +C
23、D25+ Treg 功能抑制试验发现，OVA 致敏、激发Balb/C 小鼠经 Hemin 干预后，抑制作用显著增加； SnPP 能逆转 HO-1 作用。IL-10 剔除的 B6.129P2-Il10tm1Cgn/J 小鼠 Treg 抑制作用经 Hemin 干预后仍未改善。研究表明：HO-1 可能经诱导 CD4+CD25+ Treg 特异性转录因子 foxp3 表达，激活 CD4+CD25+ Treg，促进 IL-10 分泌，以拮抗哮喘气道炎症 23,24；预初实验同时显示：体内经Hemin 诱导 HO-1 高表达后能明显降低由抗 CD3/CD28 抗体刺激后脾细胞分泌 IL-17，而单独或加用
24、 SnPP 后 IL-17 分泌增加，提示 HO-1 在体内具有先前未知的抑制IL-17 的免疫调节作用（图 3） ，但具体机制尚需进一步探讨。 此外我们已建立了小鼠哮喘动物模型，免疫斑联（ELISPOT）方法测定 IL-17 表达，掌握了应用 OVA 多抗原肽（multiple antigenic peptide, MAP）免疫小鼠来获得大量 OVA 特异性 Th17 细胞，并通过尾静脉注射进行细胞移植，结果详见工作基础。为本项目的开展奠定了基础。图 3 Hemin 抑制体内抗原非特异性 IL-17 分泌鉴于HO-1和Th17细胞在支气管哮喘中的作用，结合我们前期工作基础，我们认为HO-1可
25、能介导了Th17细胞分泌不同 IL-17亚型，并在哮喘发生、发展中发挥作用。本国家自然科学基金申请书 2008 版第 10 页 版本 1.003.381项目拟在HO-1表达干预前后，通过体外分离、培养OVA抗原特异性Th17 细胞，观察HO-1对Th17细胞和IL-17 等细胞因子的影响；并建立OVA致敏、激发的Babl/C 小鼠哮喘模型，采用细胞荧光标记技术标记Th17细胞，Th17细胞回输OVA致敏后的Babl/C 小鼠，通过免疫荧光、流式细胞分析技术研究Th17细胞在哮喘动物模型中的作用，探讨 HO-1、Th17细胞和哮喘气道炎症三者关系，阐明HO-1抗炎作用机制并提供临床防治新思路 （
26、图4） 。图 4 HO-1 与 Th17 细胞作用示意图国家自然科学基金申请书 2008 版第 11 页 版本 1.003.381参考文献1 Richard M, Effrosa, Hari Nagarajb. Asthma: new developments concerning immune mechanisms, diagnosis and treatment. Current Opinion in Pulmonary Medicine 2007,13:37-432 Johansson SGO, Hourihane J OB, Bousquet J, et al. A revised n
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43、J Physiol Heart Circ Physiol 2002,283(3):H861-870国家自然科学基金申请书 2008 版第 13 页 版本 1.003.3812. 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题研究内容1. 通过体内外实验，进一步明确HO-1 在哮喘气道炎症中的抗炎作用；Th17 细胞及其分泌的 IL-17 在哮喘发生发展中的作用。2. 对 HO-1 表达干预，探讨 HO-1、Th17 细胞和哮喘气道炎症三者关系，阐明 HO-1抗炎作用机制并提供临床防治新思路。研究目标通过本项目研究阐明Th17细胞及其分泌的IL-17 不同亚型在哮喘发生发展中的作用；干预HO
44、-1表达以进一步阐明HO-1是否介导Th17 细胞分泌IL-17 拮抗哮喘发生；在此基础上进一步探讨其作用机制，为早期、有效控制哮喘气道炎症提供新的理论依据。拟解决的关键科学问题尝试通过体外培养 Th17 细胞和体内小鼠哮喘模型建立，阐明 HO-1 调抑 Th17 细胞及其分泌的 IL-17，控制支气管哮喘的发生发展，为阐明该病产生机制和临床防治提供新思路是本项目要解决的关键科学问题。3. 拟采取的研究方案及可行性分析研究方法一、体外实验1OVA 特异性 Th17 细胞制备和培养采用100 g OVA 323-329肽段的MPA-OVA （由合作者 提供）免疫DO11.10小鼠（基因背景为Ba
45、lb/C小鼠，上海斯莱克实验动物有限责任公司） ，持续2天，分离正常和免疫小鼠胸腺细胞，加5 ng/ml TGF-、10 ng/ml IL-6和10 ng/ml IL-23培养4872 h。加入FITC 标记的抗小鼠CD4抗体和APC 标记的IL-17A抗体（eBioscience公司） ，荧光显微镜下观察CD4 +IL-17+细胞。2干预 HO-1 表达对 Th17 细胞和 IL-17 等细胞因子的影响设对照组、OVA 组、OVA+Hemin 组、OVA+SnPP 组和 OVA+Hemin+SnPP 组。10、30 和 50 M Hemin（Fluka，USA）或 SnPP （Alexis
46、，USA ）培养 CD4+IL-17+细国家自然科学基金申请书 2008 版第 14 页 版本 1.003.381胞 4872 h， 荧光显微镜下观察 CD4+IL-17+细胞和 ELISPOT 检测该细胞分泌 IL-17 功能。收集细胞，TRIzol 提取总 RNA，1 g RNA 逆转录，Realtime-PCR 扩增并测定各组 IL-17 mRNA 表达水平。ELISA 方法测定各组细胞因子 IL-17A/F、IL-17E、IL-4、IL-10 和 IFN- 水平。Western-blot 测定各组 HO-1 的表达量和酶活性（本方法实验室已建立） 。小鼠 IL-17 引物和 Taqma
47、n 探针序列（本实验室已合成）分别为：IL-17A 正向引物：5-GCT CCA GAA GGC CCT CAG A-3IL-17A 反向引物：5-AGC TTT CCC TCC GCA TTG A-3IL-17A Taqman 探针：5FAM-CTC TCC ACC GCA ATG AAG ACC CTG A-TAMRA 3IL-17E 正向引物：5-CAC ACT GCG TCA GCC TAC AGA-3IL-17E 反向引物：5-TGT GGT AAA GTG GGA CGG AGT T-3IL-17ETaqman：5FAM-CTC CCA CAT GGA CCC GCT GGG-TAMARA3二、体内实验1制备小鼠哮喘气道炎症模型选用本课题组已建立的哮喘模型（Zhen-Wei Xia, et al. The Journal of Immunology, 2006, 177: 5936-5945） 。Balb/C 小鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司）腹腔注射OVA（ Sigma 公司） 2 次致敏，间隔 2 周，以及腹腔麻醉后经 OVA 气道局部激发，诱导哮喘气道炎症。2 HO-1 表达干预前后肺组织 Th17 细胞及其 IL-17 等细胞因子的变化与哮喘气道炎症设对照组、OVA 组、OVA+Hemin 组
