1、实时荧光定量 PCR 实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。 一. 实时荧光定量 PCR 原理所谓实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1. Ct 值的定义在荧光定量 PCR 技术中，有一个很重要的概念 Ct 值。
2、C 代表Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是： 每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图 1 所示）。图 1. Ct 值的确定 2. 荧光域值（threshold）的设定PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍，即：threshold = 10 SDcycle 6-15 3. Ct 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 1 ，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝
3、数的对数，纵坐标代 Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。图 2. 荧光定量标准曲线4. 荧光化学荧光定量 PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料2 。现将其原理简述如下：1） TaqMan 荧光探针：PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一
4、条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。如图 3 所示。图 3. TaqMan 荧光探针工作原理2）SYBR 荧光染料：在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。二内标在传统定量中的意义1几种传统定量 PCR 方法简介 3 ：1）内参照法：在不同的 PCR 反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，
5、内标也被扩增。在 PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板 4 。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化 PCR 产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数 5 。3）PCRELISA 法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛
6、或生物素酶标抗体辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的 PCRELISA 法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的 6 。2内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即 PCR 到达平台期后进行检测，而PCR 经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在 96 孔PCR 仪上做 96 次重复实验，所得结果有很大差异（见图 4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。图 4. 相同模板在同一台 PCR 仪上进行 96 次扩增的扩增
7、曲线图终点处检测产物量不恒定；Ct 值则极具重现性三内标对荧光定量 PCR 的影响 1实时荧光定量 PCR 无需内标实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量 PCR 无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct 值的重现性PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct 值是恒定的。（见图 4）2
8、）Ct 值与起始模板的线性关系由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准曲线定量的方法。2内标对实时荧光定量 PCR 的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则 PCR 反应变为双重PCR，双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著 7,8 。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。美国 Texas 大学的科研人员进行了外标法定量
9、和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方 9 。Applied Biosystems 公司的 7700 型实时荧光定量 PCR 仪是全球公认的荧光定量 PCR 的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量 PCR 是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域 10,11,12,13 。参考文献1. Higuchi R, Fockler
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16、2000,Neurosci.Res, 59(2): 238-46.扩增曲线PCR 过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线荧光定量 PCR 中基线、阈值、 Ct 值、扩增曲线、熔解曲线等基本概念基线（Baseline）：是指在 PCR 扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大。接近一条直线，这样的直线即是基线。荧光域值（threshold）的设定：一般将 PCR 反应前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR 第 315 个循环荧光信号标准差的 10 倍，荧光域值设定在 PCR 扩增的指数期。CT 值：表示每个 PCR 反应管内荧光信号到达设定的
17、域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT 值越小。反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数。纵坐标代表 CT 值。因此，只要获得未知样品的 CT 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。判断扩增曲线是否良好的指标主要有几个方面：1、曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好，基线平而无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。2、曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高。3、标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势。4、各管的扩增曲线平行性好，表明各反应管的扩增效率相近。熔解曲线对 PCR 产物加热，随着温度的升高，双链扩增产物逐渐解链，导致荧光强度下降，到达某一温度时，会导致大量的产物解链，荧光急剧下降。利用该特点以及不同 PCR 产物其 Tm 值的不同，因此使其荧光信号发生迅速下降的温度也不同，可通过此对 PCR 的特异性进行鉴定。
