1、烟草及烟草制品 棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸的测定 气相色谱-火焰离子化检测器法标准编制说明贵州省烟草科学研究院2017 年 5 月1目 录一、编制的目的和意义 .2二、任务来源及编制工作过程 .2三、标准制定原则 .3四、标准的构架和主要内容及指标确定的依据 .4（一）标准的构架 .4（二）标准的适用范围 .4（三）标准的研制内容 .4（1）前言 .4（2）材料与试剂 .5（3）前处理方法 .5（4）色谱检测方法 .6（5）前处理条件优化 .6（6）衍生化产物稳定性研究 .8（四）指标确定的依据 .8（1）定量参数验证 .8（2）标准应用 .10五、与现行相关法律、法规、规章及相关标准，特
2、别是 强制性标准的协调性 .12六、专利及涉及知识产权 .12七、分歧意见的处理经过 .13八、标准作为强制性或推荐性标准的建议 .13九、贯彻标准的要求和措施建议 .13十、废止现行有关标准的建议 .13十一、其他应予说明的事项 .13十二、推广应用的预期效果 .14十三、标准水平分析 .142一、编制的目的和意义有机酸是一类含有羧基的化学物质，具有抑菌、抗病毒、增加冠脉流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、消炎、抗突变、抗癌、软化血管，促进钙、铁元素的吸收、帮助胃液消化脂肪和蛋白质等生理功能，对许多食品的风味口感和营养价值都有重大的影响，因此一直备受关注。烟草中的有机酸主要指除氨基酸以外的其它
3、有机酸。有机酸广泛存在于烟草中，含量约为 10%16%，有机酸的种类与含量直接影响着卷烟的吸味品质。烟草有机酸可中和游离碱，调节烟气酸碱性，降低烟气的辛辣、呛喉现象，改善余味使烟气变得舒适。因此，对烟草中有机酸含量的分析，对评定烟叶的品质、判断烟气是否醇和、指导烟叶生产和叶组配方等具有重要作用。烟草行业出台的检测标准为YC/T 288-2009 烟草及烟草制品 多元酸（草酸、苹果酸和柠檬酸）的测定 气相色谱法 ，但该方法检测的有机酸种类较少（主要为 3 种低级多元酸） ，未包含烟草中主要高级脂肪酸（棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸）的测定，无法完全反映有机酸对烟草品质的影响，且现行标准前处理过程
4、复杂，需要冷凝回流衍生化和多次萃取，从而导致方法的重复性相对较差。因此，制定简单、易操作的烟草中主要高级脂肪酸的标准检测方法对统一评价烟草品质具有重要影响。烟草中有机酸的种类繁多，含量及性质差异较大，建立测定对烟叶品质有重要作用的多种有机酸的标准分析方法，可以进一步提高检测方法的准确性，为建立完善的质量评价体系及研究平台提供更为全面准确的检测依据。二、任务来源及编制工作过程（一）任务来源本标准于 2014 年由贵州省烟草科学研究院首次提出，上报贵州省烟草专卖局（公司）后，再经贵州省质量技术监督局批准，被列入贵州省 2014 年第一批标准化立项项目计划。项目获批后，我院成立了标准起草工作组，认真
5、完成了方案制定、项目实施、总结梳理、标准编制、征求意见等多项工作。3（二）编制工作过程3.1 项目启动和文献调研阶段（2014 年 5 月2014 年 8 月）项目负责人召开项目启动会，对项目研究人员进行了明确分工，并制定了项目实施方案。项目组通过对文献、标准、专利等进行调研，收集高级脂肪酸（棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸）的色谱检测方法，并对收集的资料进行汇总、整理、分类。同时，结合行业的实际情况，提出初步意见和构想。3.2 标准方法实验室研究阶段（2014 年 8 月2015 年 6 月）3.2.1 前处理条件和色谱条件的优化（2014 年 8 月2014 年 12 月）项目组在文献报道方
6、法的基础上，对比优化了样品的前处理方法和色谱分析条件，利用单因素分析实验优化了衍生化催化剂种类、反应时间、稀释液与萃取溶剂的加入量，从中选择最佳的衍生化与萃取条件。3.2.2 方法学验证及样品测试（2015 年 1 月2015 年 6 月）对优化的方法进行线性、重复性、回收率及稳定性验证，确保方法可靠（线性大于 0.999， 5 次重复试验的 RSD 小于 5%，回收率大于 90%，48 h 内衍生化产物稳定等） 。选择典型的烟草样品进行典型样品高级脂肪酸（棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸）的色谱分析，进一步验证方法的可靠性。3.3 标准方法初稿起草阶段（2015 年 7 月2015 年 10
7、月）完成标准方法初稿的起草工作，在前期大量实验的基础上撰写项目研究报告。3.4 项目总结阶段（2015 年 10 月-2017 年 4 月）项目牵头单位对形成的烟草及烟草制品 棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸的测定 气相色谱-火焰离子化检测器法标准征求意见稿，同时在网上发布关于征求贵州省地方标准烟草及烟草制品 棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸的测定 气相色谱-火焰离子化检测器法的标准意见函，广泛征求行业内外的意见。三、标准制定原则本标准符合以下制定原则：4（1）符合地方标准制修订管理工作规程对编制程序和工作的规定和要求。（2）符合地方标准检测技术的有关要求，适应行业的技术特点。（3）符合标准的科学
8、性、先进性、实用性。标准的技术指标确定要有可靠的技术支撑。（4）符合国家法律、法规的有关要求，不与已有标准冲突。四、标准的构架和主要内容及指标确定的依据（一）标准的构架本标准由目次、前言、正文和附录 A 四部分组成。其中正文共 9 章，为范围，规范性引用文件，原理，试剂，仪器与材料，样品制备，分析步骤，精密度和回收率，检测报告。（二）标准的适用范围本标准适用于烟草和烟草制品中棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸的测定。（三）标准的研制内容（1）前言有机酸是一类含有羧基的化学物质，具有抑菌、抗病毒、增加冠脉流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、消炎、抗突变、抗癌、软化血管，促进钙、铁元素的吸收、帮助胃液消
9、化脂肪和蛋白质等生理功能，对许多食品的风味口感和营养价值都有重大的影响，因此一直备受关注。烟草中的有机酸主要指除氨基酸以外的其它有机酸。有机酸广泛存在于烟草中，含量约为 10%16%，有机酸的种类与含量直接影响着卷烟的吸味品质。烟草有机酸可中和游离碱，调节烟气酸碱性，降低烟气的辛辣、呛喉现象，改善余味使烟气变得舒适。因此，对烟草中有机酸含量的分析，对评定烟叶的品质、判断烟气是否醇和、指导烟叶生产和叶组配方等具有重要作用。由于有机酸在烟草中的重要作用，已有较多的文献对烟草中的有机酸进行5分析，检测方法主要有气相色谱、气质联用、液相色谱、离子色谱法等。目前较成熟的检测方法有气相色谱法、气质联用法和
10、液相色谱法。气质联用法尽管具有定性和定量的能力，但质谱检测器没有火焰离子化检测器稳定，操作相对复杂，且质谱检测器也没有火焰离子化检测器使用普遍。此外液相色谱分离能力远远低于气相色谱，对有机酸的分离不够完全。因此，气相色谱-火焰离子化检测器对有机酸进行测定具有简单、稳定及快速等优点。烟草行业出台的检测标准为 YC/T 288-2009 烟草及烟草制品 多元酸（草酸、苹果酸和柠檬酸）的测定 气相色谱法 ，但该方法检测的有机酸种类较少（主要为 3 种低级多元酸） ，未包含烟草中主要高级脂肪酸（棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸）的测定，无法完全反映有机酸其对烟草品质的影响，且现行标准前处理过程复杂，需要
11、冷凝回流衍生化和多次萃取，从而导致方法的重复性相对较差。因此，制定简单、易操作的烟草中主要高级脂肪酸的标准检测方法对统一评价烟草品质具有重要影响。本研究主要以己二酸为内标物质，采用 10%的硫酸甲醇溶液常温常压进行甲酯化，再利用二氯甲烷对甲酯化衍生产物进行萃取，提取液直接进行气相色谱-火焰离子化检测器测定，同时分析烟草及烟草制品中的棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸，该方法简单、快速、准确，适合批量样品的检测与分析。（2）材料与试剂（1）试剂：浓硫酸（分析纯，含量95%） ，甲醇（分析纯） ，二氯甲烷（分析纯）均购于国药集团化学试剂有限公司。纯度大于 97%的标准品（棕榈酸，亚油酸，亚麻酸和硬脂酸
12、）购于 Sigma-Aldrich 公司。超纯水由 Milli-Q Element 型超纯水系统获得 (美国 Millipore 公司） ，按照 GB/T 6682-2008 执行。（2）仪器：50 mL 离心试管（带旋盖） ，Thermo TRACE GC ULTRA 气相色谱仪（带火焰离子化检测器） ，旋转振荡仪（德国 IKA 仪器公司） ，离心机（3000 转/分钟） ，AB104-S 型电子天平(感量 0.0001 g，瑞士 Merrier Toledo 仪器公司) 。6（3）前处理方法将烟叶样品粉碎后过 40 目筛，按照 YC/T 31-1996 执行制备烟草样品并测定水分含量后，准
13、确称取 100 mg 烟末(精确至 0.1 mg)置于 50 mL 试管中，准确加入 100 L 己二酸内标溶液和 2 mL 10% 硫酸- 甲醇（体积分数）溶液，旋紧旋盖，涡旋振荡 2 min，室温放置过夜 24 h2 h，进行甲酯化反应。然后加入 5 mL 去离子水，5 mL 二氯甲烷，旋紧旋盖，涡旋振荡 3 min 后离心（3000 转/ 分钟，离心 5 min） ，取下层清液进气相色谱分析。每个样品应平行测定二次，两次平行测定值间的相对平均偏差不应大于 5%。（4）色谱检测方法毛细管柱：TR-5（60 m0.32 mm0.25 m） ； 进样量：1 ul，不分流；进样口温度：250；载
14、气：N 2，恒流，2.0 mL/min；程序升温：40下保持 5 min，然后以 5/min 的速率升至 260，保持 10 min，一共运行 59 min；检测器：火焰离子化检测器；检测器温度：260。检测器气体流量 N2、H 2 及 O2 分别为 30、35 及 350 mL/min。采用比较标准与样品保留时间对棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸进行了定性，己二酸内标法进行定量。（5）前处理条件优化5.1 不同衍生化催化剂的优化选用三种常见的酯化催化剂（硫酸、盐酸和对甲基苯磺酸）进行比较，实验用 5%、10% 与 15%的催化剂- 甲醇溶液进行 24 h 衍生化，称取相同烤烟样品 27 份，分
15、成 3 组，重复 3 次进行，结果取测定结果的平均值及标准偏差，结果见表 1。由表 1 可知，硫酸的衍生化效率最高，这可能与硫酸的吸水性有关，酯化反应产生的痕量水不会对反应产生影响。5%、10%与 15%的硫酸-甲醇催化剂中 10%已经达到最大的提取衍生化效率，因此选择 10%的硫酸-甲醇溶液为衍生化提取溶剂。7表 1 不同催化剂类别对烟草脂肪酸提取的影响/单位：mg/g催化剂类别 棕榈酸 亚油酸 亚麻酸 硬脂酸5%盐酸 0.980.11 0.770.08 1.520.09 0.250.0310%盐酸 1.160.08 0.870.06 1.920.08 0.290.0315%盐酸 1.290
16、.08 1.010.06 2.090.07 0.380.025%对甲基苯磺酸 1.280.10 0.980.11 1.960.12 0.350.0210%对甲基苯磺酸 1.480.07 1.190.06 2.530.09 0.420.0315%对甲基苯磺酸 1.560.06 1.240.07 2.760.10 0.450.035%硫酸 1.450.08 1.150.07 2.480.11 0.410.0310%硫酸 1.610.05 1.380.05 2.850.06 0.480.0215%硫酸 1.620.06 1.360.06 2.840.07 0.490.025.2 不同衍生化反应时间的
17、优化选用 10%的硫酸- 甲醇溶液优化不同的衍生化反应时间，反应时间分别为6 h、12 h、18 h、24 h、30 h 和 36 h，称取相同烤烟样品 18 份，分成 6 组，重复 3 次进行，结果取测定结果的平均值及标准偏差，结果见表 2。由表 2 可知，24 h 的衍生化时间已经达到衍生化反应平衡，此外，实验中还发现偏差 2 小时内，衍生化效率改变较小，为了更方便于样品检测，选择 24 h2 h 为衍生化反应时间。表 2 不同衍生化时间对烟草脂肪酸提取的影响/单位：mg/g衍生化时间 棕榈酸 亚油酸 亚麻酸 硬脂酸6 h 0.870.10 0.780.08 1.540.09 0.290.
18、0312 h 1.240.07 1.090.08 2.090.08 0.350.0318 h 1.560.05 1.240.06 2.630.07 0.450.0224 h 1.620.04 1.370.05 2.870.07 0.490.0230 h 1.610.04 1.380.04 2.880.06 0.490.0236 h 1.630.03 1.390.05 2.860.07 0.500.025.3 去离子水加入量的优化采用 10%的硫酸- 甲醇溶液衍生化反应 24 h2 h 后，加入 2.5 mL、5 mL和 7.5 mL 不同体积的去离子水进行稀释萃取，称取相同烤烟样品 9 份，分
19、成 3组，重复 3 次进行，结果取测定结果的平均值及标准偏差，结果见表 3。5 mL的去离子水加入量达到最佳的萃取效率，2.5 mL 的去离子水加入量的效率较低可能由于其甲醇水溶液中甲醇比例过高，部分高级脂肪酸衍生物溶解在甲醇水溶液中，不能有效被萃取。表 3 不同去离子水加入量对烟草脂肪酸提取的影响/单位：mg/g去离子水加入量 棕榈酸 亚油酸 亚麻酸 硬脂酸82.5 mL 1.520.07 1.180.06 2.520.07 0.440.035 mL 1.620.06 1.370.04 2.870.08 0.490.027.5 mL 1.610.06 1.380.05 2.850.07 0.
20、480.025.4 二氯甲烷萃取溶剂的优化采用 10%的硫酸- 甲醇溶液衍生化反应 24 h2 h，加入 5 mL 去离子水稀释后，再加入 2.5 mL、5 mL 和 7.5 mL 不同体积的二氯甲烷萃取液进行萃取。称取同一烤烟样品 9 份，分成 3 组，重复 3 次进行，结果取测定结果的平均值及标准偏差，结果见表 4。由表 4 可知，5 mL 的二氯甲烷萃取液获得最佳的萃取效率。因此选择 5 mL 二氯甲烷进行萃取。表 4 不同二氯甲烷萃取液对烟草脂肪酸提取的影响/单位：mg/g二氯甲烷加入量 棕榈酸 亚油酸 亚麻酸 硬脂酸2.5 mL 1.580.08 1.280.07 2.690.09
21、0.450.025 mL 1.630.06 1.390.05 2.840.07 0.480.027.5 mL 1.640.07 1.370.06 2.830.07 0.470.02（6）衍生化产物稳定性研究对同一衍生化产物样品在 6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h后重复进样，样品进样完后在常温条件下放置，结果如表 5 所示，其相对标准偏差在 0.7%-2.1%之间，结果表明：衍生化产物在常温条件下稳定性较好，不会产生降解及其它影响定量的副反应。表 5 衍生化产物样品的稳定性试验研究/单位：mg/g脂肪酸种类 6 h 2 h 8 h 24 h 30 h
22、36 h 42 h 48 h 相对标准偏差棕榈酸 1.65 1.63 1.60 1.64 1.62 1.65 1.66 1.62 1.2%亚油酸 1.39 1.39 1.41 1.38 1.35 1.41 1.40 1.44 1.8%亚麻酸 2.89 2.85 2.88 2.90 2.91 2.90 2.88 2.91 0.7%硬脂酸 0.50 0.48 0.47 0.48 0.48 0.47 0.48 0.49 2.1%（四）指标确定的依据（1）定量参数验证1.1 方法的工作标准曲线分别称取 123.2 mg 棕榈酸、129.6 mg 亚油酸、348.4 mg 亚麻酸及 97.0 mg9硬脂
23、酸于 100 mL 容量瓶中，用 100 mL 甲醇定容后利用超声波超声溶解 5 min后静置，分别得到 1.232 mg/mL、1.296 mg/mL、3.484 mg/mL 和 0.970 mg/mL的棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸标准储备液。冷藏于 4保存，有效期 3个月。取用时，放置于常温下，达到常温后方可使用。称取 972.8 mg 己二酸于 100 mL 容量瓶中，用 100 mL 甲醇定容后利用超声波超声溶解 5 min 后静置，得到 9.728 mg/mL 的己二酸标准储备液。冷藏于 4保存，有效期 3 个月。取用时，放置于常温下，达到常温后方可使用。标准工作曲线的制作为分别吸
24、取棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸标准储备液 20 uL、 50 uL、100 uL、200 uL、500 uL 于 50 mL 离心试管中，再分别加入 100 L 己二酸标准储备液，氮气吹干后，加入 2 mL 10%硫酸-甲醇溶液（体积分数） ，旋紧旋盖，涡旋振荡 2 min，室温放置过夜甲酯化反应 24 h 2 h。反应后加入 5 mL 去离子水，5 mL 二氯甲烷，旋紧旋盖，涡旋振荡 3 min 后 3000 rpm 离心 5 min，取下层有机相过 0.22 m 尼龙针式滤头后进行气相色谱 -火焰离子化检测器测定。以标准物质的峰面积/内标物质的峰面积为纵坐标（ Y） ，标准物质的质量/内
25、标物质的质量为横坐标（X） ，拟合一元一次方程（Y=a+bX） ，分别得到棕榈酸、亚油酸、亚麻酸及硬脂酸的标准工作曲线和相关性系数。一般来说，相关性系数（R 2）大于 0.999，则表明该标准工作曲线可靠。从表 6 可以看出，在设定的质量浓度范围内，各高级脂肪酸的质量浓度比与其峰面积比都呈良好的线性关系。表 6 方法的线性回归方程、相关系数、线性范围脂肪酸种类 回归方程 内标质量 标样质量范围 标样与内标质量比值范围 R2棕榈酸 Y=1.6492X+0.0132 972.8 ug 24.64-616.00 0.0254-0.6333 0.9999亚油酸 Y=1.0878X-0.0053 972
26、.8 ug 25.92-648.00 0.0267-0.6662 0.9999亚麻酸 Y=1.2721X+0.0129 972.8 ug 69.68-1742.00 0.0717-1.7907 0.9998硬脂酸 Y=1.468X-0.0026 972.8 ug 19.40-485.00 0.0200-0.4986 0.99991.2 方法的准确度与精密度称取 100 mg 相同烤烟烟末样品 10 份，分成 2 组，一组 5 份，分别进行低浓度与高浓度添加。对于没有空白样品的物质添加，一般添加量是其本身含量约为 0.5 和 1 倍二个添加浓度梯度进行试验。添加后按照“3 前处理方法”进行样品处理及分析，回收率计算公式为：回收率=（测定总量-本身含量）/ 添加量，
