1、第五章 神经营养因子第一节 神经营养因子的生物学基础一、神经营养因子的发现与发展历史1、定义一般将神经营养物质(neurotrophins) 和对神经细胞存活具有调节作用的生长因子统称为神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs)。2、发现与发展历史50 年前神经生长因子(nerve growth factor，NGF) 的发现开辟了肽类生长因子的纪元。具有神经元特异性的 NGF 成为第一个被发现的细胞生长因子，也是最典型的神经营养因子。二十世纪五十年代初，Levi-Montalcini 利用鸡胚背根节组织培养技术建立了检测该活性分子生物活性的经典方法(图 5-1)。不
2、久她又和 Cohen 一起相继找到了两种富含这种物质的生物材料 蛇毒和小鼠颌下腺。1959 和 1960 年先后从中分离纯化出这种促神经生长的、可溶性蛋白质，之后命名为神经生长因子(NGF)。NGF 的发现使人们认识到，在神经系统的发生过程中，需要一些能促进神经元发育、生长和维持其活性的因子，由此开辟了神经生物学的新领域，Levi-Montalcini 和 Cohen 也因此获得了 1986 年度诺贝尔生理学奖。图 1 神经生长因子(NGF) 的神经营养活性 左侧未加 NGF 的鸡胚背根节，右侧加入 NGF 的鸡胚背根节，可观察到 NGF 的促进突起生长的作用。由 于 NGF 只 选 择 性
3、地 对 几 类 神 经 细 胞 有 作 用 ， 人 们 推 测 还 有 其 它 类 型 的 神经 营 养 因 子 存 在 。 近 二 十 年 来 又 陆 续 发 现 九 种 新 的 神 经 营 养 因 子 。 1982 年 Barde等 从 脑 中 分 离 到 脑 源 性 神 经 营 养 因 子 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)。1989 年 ， BDNF 的 基 因 被 克 隆 。 1990 年 ， 根 据 BDNF 和 NGF 中 保 守 性 最 强 部 分的 序 列 ， 利 用 PCR 等 技 术 ， 几 个 实 验 室 几 乎 同 时
4、发 现 了 NGF 基 因 家 族 的 第 三 个成 员 ， 如 脑 源 性 神 经 营 养 因 子 (brain-derived neurotrophic factor)、 神 经 营 养 素 -3(neurotrophin-3 NT-3)、 神 经 营 养 物 质 4/5(neurotrophin-4 5， NT4 5)、 神 经 营养 素 -6(neurotrophin-6， NT-6)、 睫 状 神 经 营 养 因 子 (ciliary neurotrophic factor， CNTF)和 胶 质 细 胞 源 性 神 营 养 因 子 (glia cell line-derived n
5、eurotrophic factor， GDNF)。 由 于 它 们 的 氨 基 酸 序 列 相 似 ， 因 此 统 称 为 NGF 家 族 或 神 经 营 养因 子 (neurotrophic factors， NTFs)”。 二、神经营养因子的分子特点神经营养因子主要包括 NGF，BDNF ，NT-3 ，NT-4/5 等。作为同一家族的成员，它们的基因结构十分相似，都起源于同一基因家族。图 5-2 大鼠 NGF，BDNF，NT-3 氨基酸序列及可变区（方框内）从测序后推导的氨基酸序列来看，它们都有较大的前体，它们成熟活性多肽的氨基酸序列分为保守区和可变区，这些区域可能与它们的功能有关。它们
6、的活性形式均为二聚体，氨基酸序列同源性大于 50%(图 5-2)。它们成熟活生多肽的等电点均大于 9.0，人 NGF，BDNF ，NT-3 和 NT-4/5 分别由120，119，119 和 130 个氨基酸组成(表 5-1)。表 5-1 神经营养因子的理化性质等 电 点 前 体 氨 基 酸 数活 性 蛋 白氨 基 酸 数分 子 量(kDa)N-端 糖基 化 位 点二 硫 键 数NGF(人 ) 10 241 120 26 3 3NGF(小 鼠 ) 10 241 370 313 118 26 3 3BDNF(人 ) 9. 99 247 119 27 0 3BDNF(小 鼠 ) 9. 99 249
7、 119 27 0 3NT-3(人 ) 9. 5 257 119 27 0 3NT-3(小 鼠 ) 9. 5 258 119 27 0 3NT-4(人 ) 210 130 14 0 3NT-4(小 鼠 ) 209 130 14 0 3第 二 节 神经营养因子受体一、神经营养因子受体的种类NTs 通过与两种类型细胞表面受体，即 TrK 酪氨酸激酶和 p75NT 受体(p75NTR)相结合来调控神经元的活存、分化、生长和凋亡。这些受体通常共存于同一细胞上，调节神经元对 NTs 的反应。NT 受体的功能从发育的神经系统可塑性到损伤神经元的活存和再生极为重要。Trk 受体介导正向信号如促进生长和活存，
8、p75NTR 则介导正向和反向信号。两类受体发出的信号相互间或一致或对立。NT 信号转导的关键问题是两种 NT 受体在一起如何调节细胞对 NTs的反应以及这些受体在行使其作用时所采用的胞内信号的性质。近年来，促进NT 作用的一些新的受体胞内信号蛋白及信号转导途径已被确认。1、Trk 受体及其作用Trk 即原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase)，是原癌基因 trk 的产物，由原肌球蛋白和酪氨酸激酶融合产生，分子量为 120160kD 的单跨膜糖蛋白，是受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族中的成员，该家族有相类似的结构
9、，由胞外一个大的糖基化的配体结合区、跨膜区(TM)、胞内区(可分为近膜区、酪氨酸激酶区、羧基尾区)组成，其中胞外区含亮氨酸富集结构(leucine rich motif， LRM)和免疫球蛋白区(IgG 区)。两个位于 LRM 旁侧的半胱氨酸簇，将 Trk 同酪氨酸激酶家族的其它成员相区别；而 LRM 决定了与配体结合的特异性。Trk 受体分为 TrkA(分子量 140kD)、TrkB(145kD) 和 TrkC(145kD)，其相应的配基分别为 NGF、BDNF 和 NT-3，TrkB 的另一个配基为 NT45，NT-3 也可作用于 TrkA 和 TrkB。NTs 家族成员主要通过 Trk
10、受体的自身磷酸化进行信号转导，产生效应；该类受体与 NTs 结合后缓慢释放，其解离常数为 10-1molL ，故又称为高亲和力受体(图 5-3)。图 5-3 神经营养因子受体及其功能p75NT 受 体 (p75NTR) 在 NTs 受 体 中 还 有 一 个 分 子 量 为 75kD(p75NTR)的 低亲 和 力 受 体 ， 它 能 与 所 有 的 NTs 以 相 似 的 亲 和 力 结 合 (NT-6 尚 不 明 确 )， 解 离 常 数为 10-9mol L， 是 富 含 半 胱 氨 酸 的 图 5-4 NGF 与 p75NT 受 体 的 结 合 糖 蛋 白 (图 5-4)。图 5-4二
11、、神经营养因子的生物活性1、发育期（1）促进神经元活存、生长和分化成熟的作用：神经元进入成熟阶段的标志包括突起的充分发育和突触形成，神经元特异递质合成酶的表达，以及膜离子通道和膜电位的出现。NTFs 对发育中神经元在上述形态学和生物化学等方面指标有促进作用。NGF 对外周交感神经元、背根节感觉神经元和中枢胆碱能神经元从发育到成熟的过程具有生理作用。（2）对神经递质选择的作用：在神经元分化初期，其递质属性尚未确定，在发育过程中必然经历递质选择。递质选择主要取决于从细胞迁移至最终定位所经历的环境因素。例如，成熟交感神经节中的大多数是去甲肾上腺能神经元，也有少量支配汗腺的胆碱能神经元。NGF 是促进
12、交感神经元内去甲肾上腺素酶系发育的主要生长因子。而那些胆碱能神经元在交感节发育早期也都经历过去甲肾上腺能阶段才最终成为胆碱能表型，即经历过递质的选择和转换。（3）诱导神经纤维定向生长：从体外培养观察到，鸡胚或鼠胚背根节和长出的突起向分泌 NGF 的小鼠颌下腺生长，而不向缺乏 NGF 的舌下腺生长。在体内，NGF 是诱导神经纤维长向靶区的重要因素之一。（4）控制神经元存活数量：发育过程中有一个神经元自然死亡的减数现象，出现在神经轴突长人靶区后不久。NGF 效应神经元的自然减数是通过靶区 NGF水平来控制的。实验观察到，分散培养的发育期效应神经元依赖 NGF 存活；效应神经元的自然减数在时间上与靶
13、区 NGF 水平的下降相一致。2、成年期进入成年期，NTs 及其受体的表达和分布都明显减少，效应神经元对 NTs的依赖也明显降低，只有部分交感神经元仍需依赖 NGF 存活。一些外周和中枢的神经元仍需要一定水平的 NTs 维持其正常功能。3、损伤修复期神 经 损 伤 包 括 外 伤 、 疾 病 、 中 毒 、 老 化 等 因 素 造 成 的 中 枢 和 外 周 神 经 系 统的 损 伤 ， 是 临 床 医 学 至 今 难 以 解 决 的 问 题 。 成 熟 神 经 元 和 神 经 系 统 仍 保 留 一 定程 度 的 再 生 修 复 能 力 是 建 立 在 神 经 元 可 塑 性 (neuron
14、al plasticity)的 基 础 之 上 。 就 单个 神 经 元 而 言 ， 可 塑 性 使 它 在 非 致 死 性 伤 害 后 有 发 生 改 变 与 适 应 的 能 力 ； 而 就神 经 系 统 而 言 ， 则 可 利 用 活 存 的 神 经 元 ， 代 偿 死 亡 神 经 元 的 部 分 功 能 ， 从 而 减轻 损 伤 的 后 果 。4、NTFs 的基因敲除动物模型 NTFs 及其受体基因敲除(knockout) 动物模型的建立，有助于在分子水平上了解 NTFs 及其受体的功能，以及它们在神经系统发育过程中的地位和作用。NTs 及其受体的基因敲除转基因动物表型见表 5-2。表
15、5-2 NTs 及其受体基因敲除 Kn 小鼠的表型缺失基因 表 型trkA 致死性的，生后 1 个月内死亡，感觉及交感神经元缺失trkB 致死性的，生后即死亡，面神经核和脊髓运动神经元缺失，三叉神经节、背根节缺失trkC 致死性的，生后 1 个月内死亡，本体感觉缺失，运动姿势异常p75NTR 非致死性的，可存活至成年，但感觉神经元的一个亚群丢失，周围感觉和交感神经分布缺陷ngf 非致死性的，但出生后，体中增加停止、长疮、出现自毁颂向，感觉和交感神经细胞缺失bdnf 致死性的，感觉神经缺陷，颅神经节、外周神经节缺失，最严重的是前庭神经节细胞显著丧失，因此其形维表现为旋转、共济失调和呈弓状姿势nt
16、-3 致死性的，感觉和交感神经元丧失，脊髓传入纤维数目下降，与传递本体感觉有关的感受器(肌梭和 Golgi 腱器)nt-45 正常，10 个月内无明显的神经元和表型异常bdnf+at-45 致死性的，与单纯 BDNF 缺陷相似从上表看。NTs 及其受体基因缺失，将会严重影响神经系统的发育，甚至发生个体的死亡。NTs 的基因敲除动物模型在 PNS 中表现为特异的靶神经元缺失，不同的 NTs 支持相应的特异性神经元群；在 CNS 中基因敲除的靶神经元缺失不明显，NTs 的作用以调节功能为主。NTs 及其 Trk 受体成员之间，甚至相应的配基与受体之间的基因缺失可导致不同的表型。TrkA、TrkB、
17、TrkC、BDNF 和 NT-3 的基因缺失均为致死性的，说明这些 NTs和受体在神经系统发育中有更重要的作用，而 NGF 的作用可能通过 NT-3 作用于 TrkA 来实现； NT-4 5 的作用可被 BDNF 作用于 TrkB 所代偿。但TrkA、TrkB 和 TrkC 的作用是必须的，其作用无法替代，作为受体激动剂的BDNF 和 NT-3 同样不可缺少。而 p75NTB 仅在外周感觉和交感神经活动中起部分作用，不是神经活动所必须的。第 三 节 神经营养因子的临床应用前景NTFs 从研究初期就预示了临床应用的可能性，正是在这种前景的引导下，才有目的地进行了动物模型实验。这些实验的确像预期的
18、那样表明 NTFs 对某些神经损伤和疾病有着以前疗法所未达到的疗效。由于基因工程药的发展，能获得大量 NTFs 用于临床试验，但由于 NTFs 均为蛋白质，不易通过血脑屏障，故目前临床试验主要在脊髓或 PNS 疾病上进行，对 CNS 相关的疾病仍以动物模型研究为主。一、NTFs 与神经系统疾病神经系统疾病主要包括神经退行性疾病(neurodegenerative diseases)和神经损伤等。神经退行性疾病如帕金森病(Parkinsons disease，PD)、阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(amyotrophic lateral acle
19、rosis，ALS) 等，目前多无有效治疗手段。大量体内体外研究表明，NTFs 在神经系统疾病的诊断和治疗中具有临床应用价值，见表 5-3。1、运动神经元疾病ALS 是一种致死性运动神经元退行性疾病，常用药物有抗痉挛剂Baclofen，抗抽搐的 Quhine Sulfate phenytoin、Car bame zepine，抗抑郁剂三环类等。目前尚无有效治疗措施。体内体外研究表明，发育及成熟运动神经元对BDNF、NT-3、NT45 有反应，BDNF、NT-3 增加培养的胚胎大鼠运动神经元的活性，BDNF 可防止运动神经元的自然死亡，并对损伤的新生大鼠面部运动神经元有保护作用；当神经切断后，B
20、DNF、NT-3 逆行运输到运动神经元急剧增加，外源性 BDNF 能延迟自然发生 MND(motor neuron disease)中的运动失调，减轻神经肌肉萎缩和运动轴突消失，这些研究为应用 BDNF 治疗 ALS 提供了理论基础。目前，BDNF 已进入治疗 ALS 的临床试验阶段。表 5-3 神经营养因子的选择活性及临床应用可能疾 病 作 用 部 位 NGF BDNF NT-3 NT-45 CNTF GDNF感觉神经元 外周神经病交感神经元 ALS 运动神经元 基底前脑胆碱能神经元 皮层神经元 AD海马神经元 PD 多巴胺能神经元 HD 纹状体神经元 局部缺血 皮层神经元 急性脑脊髓损伤皮
21、层脊髓神经元 2、帕金森病 PD它是由于黑质纹状体多巴胺能神经元的进行性退化而引起的运动失调症。其神经元退化进程远在临床症状出现之前。目前常用的药物有 DA 的前体左旋多巴(EDOPA) 及多巴胺(DA) 受体激动剂。这些药物副作用大，并不能改变神经元退化。由于 BDNF 对多巴胺神经元的特殊营养作用，并对 DA 能神经元选择性毒性物质 6-OHDA 和 MPP+损伤的神经元有保护作用。大量的体内体外实验研究表明 BDNF 有望用于 PD 的治疗。GDNF 是目前发现对 DA 能神经元作用最强的因子之一，在 PD 动物模型中，单次脑内注射 100 和 450g GDNF，能扭转 DA 能神经元
22、变性，且不会出现运动障碍，效果好于 L-多巴。尽管 GDNF 效应较强，但其作用范围较广，对多种神经元有作用，故在临床应用上，需考虑 GDNF 可能产生的多种作用。3、早老性痴呆(AD)AD 的病理变化为广泛的大脑皮层神经元丧失，尤其是海马和基底前脑胆碱能神经元退化。临床常用药物有胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐等能够提高患者认知功能。有恶心、腹泻、失眠等不良反应外，并不能减慢神经元的退化。NGF 能防止前脑胆碱能神经元的萎缩，提高出现认知损伤的老年大鼠的胆碱乙酰转移酶 ChAT 水平，增加存活胆碱能神经元的功能，提高记忆。这些现象为 NCF 用于AD 治疗提供了理论基础。神经营养素因子家族其他成员如
23、BDNF、NT-3、NT45 均能维持胆碱能神经元存活，上调其 ChAT 表达，且有比维持神经元存活更为广泛的作用，这些广泛作用与 AD 尤其有关的胆碱能神经元也有营养作用，能扭转运动活性下降，改善运动失调。多种神经营养因子的联用可能产生最佳效果。目前，用损毁大鼠基底前脑胆碱能投射系统复制 AD 症状，但并不能完全模拟 AD 病人的所有病症，因此尚需建立更为合适的动物模型。4、外周感觉神经病外周感觉神经元退化是外周神经病的常见病症，往往由糖尿病、抗癌药(如顺铂) 、酒精中毒、艾滋病(AIDS)、遗传因素等引发。 NGF 用于外周感觉神经病的临床试验已经开始，长期治疗可延缓感觉功能减弱并能使部分
24、丧失的功能恢复。除上述疾病以外，BDNF、NT-3、NT45 对听神经损伤、视神经损伤也有保护作用， NTs 在神经胶质瘤、成神经细胞瘤等疾病治疗中也有应用前景。5、急性神经系统损伤和脑缺血机械损伤或脑缺血引起的急性神经系统损伤目前尚无有效的药物治疗。NGF 脑室注射可抑制沙土鼠脑缺血后引起的海马神经元死亡；BDNF 和NT4 5 则可明显减少因结扎大鼠大脑中动脉而引起的梗死面积；动物实验表明NTFs 可减少因缺血中风引起的神经元变性，并改善症状；BDNF、NT-3 和 NT-45 均能增加皮质神经元对葡萄糖和氧的利用二、神经营养因子的临床应用策略由于神经营养因子难以通过血脑屏障，故不能直接通
25、过全身给药治疗中枢疾病，因而关于神经营养素的给药方式和提高其利用效率显得尤为重要。1、脑内给药方式(1) 用机械微泵装置将 NTFs 盲接注入脑内。如 hrNGF 脑室给药可作为NGF 治疗 AD 的有效给药方式；(2) 将活性蛋白因子包裹式制备脂质体或微囊化后植入脑内，可作为体内一种有效的释放系统治疗中枢神经系统疾病。(3) 利用脑移植手段，如以胚胎黑质或自体，肾上腺髓质嗜铬细胞为供体治疗 PD，移植后注入 NGFs 可提高移植物的存活率，并可增强治疗作用。(4) 通过细胞移植将有持续分泌神经营养因子活性的遗传修饰细胞植入脑内。一是直接移植分泌 NTFs 的工程细胞，二是将遗传修饰细胞微囊化
26、后移入脑内。(5) 直接将神经营养因子基因导人 CNS 细胞内以增加神经营养因子的表达水平。2、利用蛋白修饰手段增加神经营养因子通过血脑屏障的能力有人将 BDNF 与能穿越血脑屏障的载体 (如 NLA-OX26)结合形成载体介导肽药，穿过血脑屏障而运送人脑发挥其特殊的生物作用。3、改造基因序列利用基因工程手段增加因子的功能，扩大因子的应用范围 将 NGF、BDNF、NT-3 的活性结构域组人到 NT-3 基因主架中，表达名为 PNT-1的合成营养因子，它能与 Trk 受体及 p75NTR 结合，其神经营养作用与三种因子联用相当，注入坐骨神经后显示很强的逆行运输到 DRG 神经元的能力。这一结果
27、表明 PNT-1 是强有力的、多特异性的神经营养因子，有望用于外周神经病和神经损伤。用痘病毒表达系统或 COS 细胞将分别表达 BDNF 和 NT-3 的病毒共转染得到由 BDNF 和 NT-3 形成的异二聚体，并可使单一细胞表达多种神经营养因子。也可试图生产与 NTs 作用位点相似的活性肽片段，但通常其有效浓度比天然蛋白高。4、寻找调控 NGFs 及其受体的表达或启动信号转导的小分子物质有证据表明非蛋白激素可调节 NTFs 的表达，如糖皮质激素可防止外周神经中 NGF 的减少，刺激海马内 BDNF、NT-3 表达增加。另外 NTs 及其受体表达还受多种物质的影响，如 Glu 受体拮抗剂、cA
28、MP、视黄酸(RA)等。有许多低分子量的亲脂化合物能激活 Tyr 磷酸化的信号转导途径，这些化合物单独或与抗氧化剂和钙稳定剂联用，在局部缺血脑损伤中可起到与 NTFs 类似的有益作用，提供了治疗脑损伤的途径。总之，神经营养因子、神经活动、内分泌系统相互影响，相互作用，在神经系统的发育和成熟过程中及病理情况下发挥重要的作用。三、临床应用神经营养因子存在的某些问题1、神经营养因子的选择性目前已知的神经营养因子中除 NGF 外，作用的选择性都不高。例如 NGF除了可作用于脑内胆碱能神经系统外，还能作用于脑内单胺类神经。外周给NGF 治疗感觉神经萎缩时也不可避免地会影响外周交感神经以及免疫和生殖系统。
29、脑内大多数神经元多可表达 TrkB 和 TrkC 受体，因此作用于这两种受体的BDNF 和 NT-3 不太可能用来专门影响脑内某一类特定的神经元。此外，许多营养因子除了对神经元有营养作用外，也对非神经元细胞有作用。2、神经营养因子的免疫反应临床上神经营养因子往往需要长期应用，由于它们都是一些蛋白质，因此也要考虑它们可能产生免疫反应。脑室内给神经在子时一般影响不大，而且也未见有抗体产生。但外周给药时要考虑可能发生免疫反应。应用人重组神经营养因子可能可减少这种反应。思考题：1、什么叫神经营养因子，它包括哪些因子？2、神经营养因子的受体有哪些，其生理功能是什么？3、简述神经营养因子的临床应用。4、简述神经营养因子靶向给药的新进展。
