1、 荧光定量 PCR 检测结直肠癌腹腔 CEA 水平及其临床意义的研究【摘要】 目的：应用实时荧光定量 PCR 技术检测结直肠癌腹腔内CEA 水平并探讨其临床意义。方法：2003 年 5 月至 2004 年 3 月，收集在日本爱知癌症中心手术 107 例结直肠癌病例的腹腔冲洗液，每个样本的 cDNA 应用随机引物合成，并在罗氏的实时荧光定量PCR（ LightCycler）上进行定量分析。每个样本同时进行常规细胞学检查。所有病例术后经过平均为 1 年的随访。结果：CEA mRNA的阳性率和水平均与肿瘤的侵润度（T），分期以及淋巴结转移相关。在一个合理界定值上，CEA 和 CK20 检测的敏感度与
2、特异度均为100%和 100%,而常规的细胞学检查则为 33%和 100%。结论：CEA定量分析是检测结直肠癌腹腔微转移的敏感和特异的方法，CEA mRNA 水平的异常与术后的无瘤生存率显著相关。其临床意义有待于更长期的随访结果。 【关键词】 结直肠癌 CEA 实时荧光定量 RTPCRAbstract Objective:The purpose of this study is to detect CEA level in peritoneal cavity of colorectal cancer patients by quantitative Realtime RT PCR method
3、 and investigate its clinical significance. Methods: From May 2003 to Mar. 2004, peritoneal wash was obtained from 107 patients with colorectal cancer in Aichi cancer center. cDNA was synthesized from mRNA extracted from peritoneal washes by Random primers. Quantification of CEA mRNA was performed o
4、n a LightCycler instrument (Roche) with hybridization probe. A part of each peritoneal wash was also examined by conventional cytology. All patients were followed up for a median period of at least 12 months. Results: Both CEA mRNA positive rates and values were significantly correlated with depth o
5、f tumor invasion, tumor stage, lymph node status. Sensitivity and specificity of CEA and CK20 real time RTPCR with an appropriate cutoff value were 100%, 100%, and 100%, 100%, respectively, whereas those of conventional cytology were 33%, and 100%, respectively. Conclusion: CEA mRNA quantifications
6、is sensitive and specific method for detection of micrometastases in the peritoneal washes of colorectal cancer patients. Abnormality of CEA mRNA level in peritoneal washes is correlated with disease free survival for colorectal cancer patients. Further followup study is needed to demonstrate the cl
7、inical significance of CEA mRNA in peritoneal washes.Key words Colorectal carcinoma;CEA; Realtime RTPCR结直肠癌为常见多发的消化道恶性肿瘤，随着生活水平的提高和饮食习惯的改变，结直肠癌的人群患病率有所上升，并有年轻化趋向。全国每年约有新发结直肠癌病例 13 万。已经跃居我国恶性肿瘤死亡率的第四位。长江下游与东南沿海的江苏、浙江、上海、福建、台湾和香港地区是结直肠癌高发区。浙江省肿瘤医院资料显示，近9 年来收治率增加 98%，平均每年增加 10.9%。与 90 年代初相比，收治率则增加 515%
8、。目前，结直肠癌患者尽管接受了以手术为主的根治术，但临床上仍有 50的结直肠癌患者死于术后的肿瘤局部复发和转移, 成为手术治疗失败的主要原因1,2。因此应用先进的分子生物学技术、建立定量荧光 RTPCR 方法检测结直肠癌肿瘤标志物、术后转移的早期诊断受到高度重视。癌胚抗原（Carcinoembryonic Antigen,CEA）是分子量为 180000 的细胞表面糖蛋白，是结直肠癌细胞去分化过程中表达的一个重要标志，是最有价值的肿瘤标志物之一。90的结直肠癌、胃癌、胰腺癌有 CEA 的高表达。自 1965年应用于临床以来已作为胃肠道肿瘤的诊断和判断预后的监测指标。CEAmRNA 指标可确定结
9、肠癌及直肠癌是否发生肝转移。本研究应用实时荧光定量反转录聚合酶链式反应（RTPCR ）技术，检测结直肠癌患者手术腹腔冲洗液中游离细胞的癌胚抗原(CEA)mRNA 特异性标志物，并检测 3 磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mRNA 为内参因子3。结合术后对患者随访，研究结果将正确诊断肿瘤侵润程度和复发可能性，对结直肠癌术后转移的早期诊断有重要意义。同时为肿瘤患者术后放疗、化疗方案确定提供参考依据，以提高患者生活质量和患者生存率。1 病例和方法1.1 细胞株:人结肠癌肝转移表达 CEA 中分化腺癌细胞株，由日本爱知癌症中心癌症研究所肿瘤病理实验室建立，并培养于加入 10%小牛血清（GIBCO BRL
10、,Gaithersburg）,100 unit/mL 青霉素和 100 ug/mL 链霉素的 DMEM 培养基（Nissui Pharmaceutical, Tokyo, Japan）中。1.2 病例收集:收集从 2003 年 5 月至 2004 年 4 月在爱知癌症中心手术的 107 例结直肠癌病例，其中包括 60 例结肠癌，45 例直肠癌，以及 2 例结直肠双发癌。病例分期根据 2001 版 UICC 分期：10 例 0期，21 例 I 期，34 例期，31 例期，11 例期。病理类型为：高分化腺癌 4 例，中分化腺癌 89 例，低分化腺癌 8 例，黏液腺癌4 例，未分化癌 1 例。1.3
11、 腹腔冲洗液的收集和保存:手术开始进腹后，立刻分别用 100 mL 生理盐水冲洗盆底，和膈下，轻微搅拌后回收冲洗液。离心（1800 r/min，5 min），PBS 重新冲洗游离细胞沉淀，溶解于Isogen 溶液中 (Nippon Gene, Tokyo, Japan)，-80 度保存至使用。其中一部分冲洗液同时常规 Papnicolaou 染色，以进行细胞学检查。1.4 实时 RTPCR 检测：应用随机引物和寡核苷酸引物检测腹腔冲洗液游离细胞 CEA mRNA,CK20 mRNA 和 GAPDH mRNA，经细胞总 RNA 提取 cDNA 合成实时荧光定量 RTPCR 步骤。寡核苷酸引物为：
12、CEA 引物： 5AACTTCTCCTGGTCTCTCAGCT,5GCAAATGCTTTAAGGAAGAAG;荧光探针：5TGAAATGAAGAAACTACACCAGG,5CTGCTATATCAGAGCAACCCCAAGAPDH 引物：5TGAACGGGAAGCTCACTGG,5TCCACCACCCTGTTGCTGTA荧光探针： 5TCAACAGCGACACCCACTCCT,5CACCTTTGACGCTGGGGCTPCR 的扩增使用 Roche 的 LightCycler 扩增仪，总反应体积为 10 ul 包括：Taq DNA 聚合酶， dNTP 混合物和缓冲， (LightCycler DN
13、A Master hybridization probes, Roche), 4.0 mM MgCl2, 0.25 uM 引物 D和 E, 0.4 uM 的探针， 1 ul 的模板 cDNA,于 Roche 的毛细管中。95(10 秒 )变性， 50 -55 (10 s)淬火，72 (10 s)延伸，共 50 次循环，每次试验包括 6 个外对照管，1 个阴性对照管，和未知浓度患者样品管。mRNA 的定量可在 LightCycler 上与标准曲线对照后由软件自动计算得出。1.5 统计分析:根据肿瘤浸润深度 T，肿瘤分期，淋巴结转移，应用卡方检验进行组间 CEA mRNA 值显著性的差异。无瘤生存
14、率用KaplanMeier 方法计算。1.6 术后随访：所有病例均入全日本结直肠癌病例库并按照爱知癌症中心术后随访程序随访，无失访。随访截至日期到 2005 年 12月 31 日。2 结 果2.1 常规细胞学检查:所有 107 例病例均做常规术中脱落学检查，只有 2 例（1.9%）诊断为阳性。2.2 结直肠癌腹腔冲洗液中 CEA 水平:利用引物合成 CEA mRNA在 10 个黏膜层和黏膜下层的早期癌中均未能检出。 根据以往在爱知癌症研究所的研究中，将界定值定在 1.0。 大于 1.0 定为阳性，小于 1.0 定为阴性。从盆底和膈下收集的标本只要有一处 CEA mRNA 值为阳性，该病例定为阳
15、性。应用实时荧光定量 PCR, 共检测了 107 例腹腔冲洗液标本，RTPCR 阳性率为 22.4%（24/107）。在 pTis1, pT2, pT3 和 pT4各组病例中，阳性率分别为 0%, 0%, 26.8%（11/41），76.5%（13/17），(P0.05) ，各组病例的平均值分别为：0，0，700.2, 1125.8。CEA mRNA 平均值与淋巴结转移关系：CEA mRNA 平均值在淋巴结转移阴性，淋巴结转移阳性病例中阳性率分别为 7.7%（5/65），45.2%（19/42）(P0.05),平均值为65.03，1687.05(P0.01)。CEA mRNA 与肿瘤分期关系：
16、在1，2，3，4 期各组病例中，阳性率分别为 0%, 14.7%(5/34),32.2%(10/31)，81.8%(9/11)，(P0.05) ，各组病例的平均值分别为：0，124.32，776.36,1119.74(P0.01)。腹腔转移阳性病例的 CEA mRNA 平均值（1196.90）显著高于腹腔转移阴性病例（36.32）(P0.01)。5 例有腹膜转移阳性的病例在镜下均诊断为 pT3pT4，其中只有一例常规细胞学检查结果为阳性（敏感度为 20%）。而实时荧光定量 PCR 结果为阳性（敏感度为 100%）。各种病理学因素，与 CEA的关系见表 1。表 1 CEA 和各种病理学因素关系2
17、.4 初步随访结果：随访时间平均为 12 个月（范围为 620 个月），共有 6 例患者出现复发和转移，其中包括腹腔内转移 2 例，肝转移 3 例，肺转移 1 例。其中 5 例患者为 CEA 阳性，复发转移率为26.3%（5/19）（剔除 5 例阳性对照）。其中有一例，手术时未发现腹膜转移，但 CEA 和 CK20 均为阳性，3 月后再手术行肝转移在切除时，探查确认腹膜转移。CEA 阳性患者与阴性患者相比较，无瘤生存率有显著差异（P0.01）。3 讨 论3.1 结直肠癌治疗失败的原因之一即是腹腔转移。常规细胞学检查一直以来作为肿瘤腹膜转移的金标准，是肿瘤 TNM 分期以外的又一肿瘤预后因素，但
18、 Wind 等4 报道，常规细胞学检查并不能为结直肠癌提供预后信息。肿瘤在进行根治手术后病例仍出现复发，原因通常被认为是手术时腹腔内即已存在从肿瘤浆膜面脱落的癌细胞，而这些脱落细胞通过常规细胞学检查未被发现。本研究中，5例阳性对照病例（腹膜转移）病理学诊断为 pT3, 其中只有一例常规细胞学为阳性，敏感度为 20%，提示建立一种新型的能检出肿瘤微小转移，具备高度敏感和特异方法的必要性。以往有利用常规RTPCR 方法来检测脱落癌细胞，Aoki 等5报道（2002）以 CEA为标记物应用常规 RTPCR 方法来检测脱落癌细胞，结果提示RTPCR 的结果与肿瘤的浸润深度有关。但常规 RTPCR 方法
19、有以下缺点3：（1）它是定性而不是定量的方法，因而缺少对于腹膜转移风险的定量预测。（2）基因扩增和随后的分析时间长，难以马上获得结果。（3）有一定的假阳性的发生率。文献报道 CEA 为(0 33%)69 。而荧光定量 RTPCR 方法具有时间短（小于 3 小时），能在手术结束之前完成。具有高度敏感性，能够检测出 107个正常细胞中的个数级别肿瘤细胞，不但远远高于常规的检验方法，而且敏感性优于常规 RTPCR3,10。而 CEA 是检测脱落癌细胞的特异性肿瘤标记物，因而通过检测 CEA 水平能够有效的监测结直肠癌腹腔的微转移。荧光定量 RTPCR 技术有带来假阳性的风险。通过设定合理界值（本研究
20、 CEA 为 1.0），能够将假阳性和假阴性控制在较低水平。通过实时荧光定量 PCR 技术，在 CEA 为标记物结果中，敏感度和特异度分别为 100%，100%。 是否要对 CEA mRNA 的值进行标化，然后再比较，一直都有争论。为了标化 CEA mRNA 的值，我们采用 GAPDH mRNA 定量测定来作为内对照，因为它反映了腹腔内脱落细胞的数量，并且与肿瘤的浸润深度无关。CEA:GAPDH 比值，与 CEA 的值一样，都与肿瘤的浸润深度显著相关，所以不必对 CEA 的值比照 GAPDH 值进行标化。这与之前在胃癌腹腔微转移研究中得到的结果是一致的。3.2 本研究的结果显示，通过引物合成
21、CEA 的阳性率以及数值，都与肿瘤的浸润深度 pT 显著相关(P0.01),同时也于肿瘤的期别呈显著相关（P0.01）。肿瘤的浸润程度越深，CEA 的阳性检出率就越高。本研究同时也发现，腹腔冲洗液中 CEA 的水平，也与肿瘤淋巴结转移显著相关(P0.01),以及肿瘤的肝转移显著相关（P0.01）。这与之前 Nakanishi 等1114在胃癌中的结果是一致的。提示随着肿瘤生长肿瘤细胞一方面外浸，另一方面则出现较高几率淋巴转移。而 Aoki 等5报道的采用常规 PCR 方法进行检测，CEA 与淋巴结转移无关不一致。以往结直肠癌病例通过淋巴结进而导致腹膜播散的未见文献报道。本试验的 5 名腹膜转移
22、阳性对照患者，肿瘤为 pT3 但区域淋巴结都伴广泛转移，并证实周围已经有腹膜播散。说明肿瘤细胞通过淋巴结转移进而导致腹膜播散的可能性仍存在。3.3 近年来对于肿瘤微转移的概念发生了改变，分为两大类：孤立性肿瘤细胞（Isolate tumour cells，ITC ）,定义为单个，多个孤立性细胞或成簇肿瘤细胞，但直径小于 0.2 mm。肿瘤微转移（Mircometastases）: 直径大于 0.2mm 肿瘤细胞团。ITC 并不表现出形态学上的转移如穿透血管，淋巴窦，肿瘤细胞的增生以及基质反应。结局有可能发展成转移，也有可能被机体免疫所消灭1517 。而荧光定量 PCR 能够灵敏的检测出 ITC
23、。Nakanishi 等11报道胃癌腹腔冲洗液中 CEAmRNA 水平是胃癌的独立预后因素（总生存率，以及腹膜无复发生存率）。本研究的随访结果也看到如此倾向，手术后复发和转移的病例 6 例中有 5 例，其 CEA 的水平在第一次手术时为阳性，提示腹腔冲洗液中 CEA 的水平异常是肿瘤复发和转移的高危因素，与术后无瘤生存率密切相关，并有显著性差异。是否是结直肠癌独立预后因素，有待于更长期随访结果的获得后进行分析。检测肿瘤 ITC 的作用不限于此，也为肿瘤的治疗提供了一个新的思路。Kurebayashi 等18在乳腺癌的动物模型，Chaudhuri 等19在卵巢癌的动物模型，均证实微转移灶对于化疗的敏感性较大转移灶高，而 Nakanishi 等20在胃癌的腹腔转移裸鼠模型中证实:通过口服化疗制剂(TS1)后，微转移灶可完全缓解甚至治愈，生存率高于腹腔大转移灶裸鼠。这就为临床治疗结直肠癌提供了一个新的策略，即分子水平的诊断（CEA 的水平）以及随后的对于具有高危因素患者的辅助化疗。近年来随着新的化疗制剂的应用于结直肠癌术后的辅助化疗，结直肠癌的生存率有了一定程度的提高。能否将此技术与结直肠癌辅助化疗结合起来，有待于今后进一步研究。【
