1、.早孕外周血及蜕膜中 NK 细胞表型及 T 淋巴细胞亚群的变化作者：肖敏, 凌斌*, 陈峥峥 , 周颖, 程志祥, 高宗侠, 冯定庆【摘要】 目的: 检测孕妇外周血及蜕膜中 T淋巴细胞亚群和 NK细胞表型, 探讨它们与母 胎界面免疫耐受的关系。方法: 收集 20例早孕同一患者的蜕膜组织及外周血, 密度梯度离心法分离出淋巴细胞, 流式细胞术（FCM）检测两组中 NK细胞、 T细胞含量及其表面分子 CD16、 NKG2A、 NKG2D表达水平。结果: 蜕膜自然杀伤（dNK）细胞占蜕膜淋巴细胞(57.154.0)%, 外周血自然杀伤（pNK）细胞占外周血淋巴细胞(11.461.58)%; dNK细胞
2、表面 CD16的表达明显低于 pNK细胞, 二者分别(10.33.9)%与(95.62.6)%(P0.05); dNK细胞表面 NKG2A的表达明显高于 pNK细胞, 二者分别为(87.104.5) %与(27.54.2)% (P0.01), dNK细胞 NKG2D的表达水平与外周血 NK细胞相近, 分别为(88.704.1)%与(93.103.6)% (P0.05); 蜕膜中的 CD4+T淋巴细胞的表达低于外周血中 CD4+T淋巴细胞, 二者分别为（13.701.0）%与(15.852.4)% (P0.05), 蜕膜中 CD8+T淋巴细胞表达明显低于外周血中 CD8+T淋巴细胞, 二者分别为
3、（15.231.5）%与（18.851.73）%(P0.01)。结论: 妊娠期蜕膜中的 NK细胞及 T淋巴细胞可能是同维持母 胎界面的免疫耐受的重要原因。 【关键词】 蜕膜 NK 细胞 T 细胞在人类妊娠过程中, 胎儿是同种异基因产物, 携带父系的异源MHCI 类分子, 却能抵御母体免疫细胞的攻击, 这与经典的移植免疫理论相矛盾1。虽然已经提出几个主要因素去解释正常妊娠的免疫生物学和妊娠相关的合并症, 但还是很局限。近年来研究发现, 子宫蜕膜组织中含有的免疫细胞包括大颗粒淋巴细胞, NK细胞, 蜕膜巨噬细胞, T淋巴细胞以及少许 B淋巴细胞, 其中 NK细胞含量最丰富, 占全部蜕膜免疫细胞的7
4、0%80%2, 其比率随着妊娠的发展而改变。随着胚胎的植入, 蜕膜自然杀伤细胞（decidual natural killer cells, dNK）的数量明显上升, 它们聚集在胎盘部位的蜕膜处与侵入的滋养层细胞密切接触并分泌多种细胞因子调节母 胎界面间的免疫平衡。dNK 细胞通过影响滋养层细胞的侵袭和分化来控制胎盘的形成。基于 dNK细胞的功能和在胚胎植入早期的大量增殖并广泛分布于滋养层细胞侵入的底蜕膜, 人们推测 dNK细胞在维持母胎界面免疫平衡中起了重要作用。最近报道认为 NK的活性是由淋巴因子调节的, 而激活的 T细胞可以释放淋巴因子调节 NK的细胞毒活性。本实验中通过比较母 胎界面处
5、 dNK, T与外周血 NK, T表型及含量的变化, 进一步揭示母 胎.界面免疫耐受的调节机制。1 材料和方法1.1 材料 在我院计划生育门诊 2006-05/2007-0120例要求人工流产、 孕 68 周的正常妊娠妇女, 平均年龄（25.25.2）岁, 既往月经规则, 无病理妊娠史, 此次妊娠期间无阴道异常出血 , B超检查提示胚胎发育正常, 有胚囊、 胚芽及心血管搏动。人淋巴细胞分离液(Ficoll)购自上海华精生物有限公司; 不同荧光素标记的鼠抗人单克隆抗体（mAb）(CD3FITC 、 CD3CY 、 CD4FITC 、 CD8PE 、 CD56CY 、 CD56PE 、 CD16F
6、ITC) 购自 BD Pharmigen公司; 澡红蛋白标记的鼠抗人mAb(NKG2APE 、 NKG2DPE) 购自 RD公司; FACS检测仪为 BD FACECalibur公司产品。1.2 方法1.2.1 标本采集 经患者同意, 人工流产术之前接上无菌负压吸引瓶, 取患者蜕膜组织, 置于盛有冰预冷的 1PBS离心管中。迅速运回实验室, 在超净台内将新鲜蜕膜组织用 PBS 洗 2、 3次, 除去血凝块, 小心去除蜕膜组织中绒毛组织。1.2.2 蜕膜和外周血单个核细胞的分离 将洗净的蜕膜组织用眼科小剪刀剪切成 1 mm左右的组织块, 置于 120目铜网中, 4 PBS冲洗, 用1次性注射器橡
7、皮头研磨, 将滤液再通过 100目铜网, 离心浓缩后溶于RPMI1640培养液, 以 11 体积比平铺于 Ficoll淋巴细胞分离液上, 2000 r/min离心 25 min, 缓慢增速, 无制动停转, 取出中间层淋巴细胞层, PBS洗涤 2次, 20 g/L台酚蓝排除法测活细胞 90%, 调细胞密度为1109/L。1.2.3 外周血单个核细胞的分离 外周血加入等体积的 PBS 稀释, 然后以 11 比例沿管壁缓慢加在淋巴细胞分离液液面上, 2000 r/min离心20 min, 吸取淋巴细胞层。用 PBS洗涤 2次, 调整细胞密度 1109/L, 20 g/L台酚蓝排除法测活细胞90%。1
8、.2.4 FCM检测细胞表面分子 取单个核细胞悬液 100 L(约1106细胞)分装至 1.5 mL EP管中, 每管分别加入 10 L 小鼠血清, 以阻断 Fc受体(空白对照管除外), 4避光放置 30 min加入相应抗体各 2 L, 标记 CD3、 CD56、 CD16、 NKG2A、 NKG2D、 CD4、 CD8避光放置 30 min, 1PBS洗涤 2次后, 加入 200 L PBS(PBS+1 g/L叠氮钠)重悬细胞, 上机检测, 用 WinMDI29软件程序分析数据。1.2.5 统计学处理 SPSS13.0 统计分析软件分析数据, 结果以 xs表示, 数据进行 t检验。2 结果2
9、.1 正常早孕 dNK细胞与 pNK细胞含量的比较 与外周血相比, 蜕膜中的 dNK细胞占蜕膜淋巴细胞的(57.154.0)%, pNK细胞占外周血淋巴.细胞(11.461.58)% (P0.05)。2.2 正常早孕 dNK细胞与 pNK细胞表型含量的比较 dNK 细胞与 pNK细胞表型差异明显, dNK细胞表面 CD16的表达明显低于 pNK细胞, 二者分别为（10.33.9)%与(95.62.6)%(P0.05); NKG2A的表达明显高于pNK细胞, 二者分别为(87.104.5)%与(27.54.2)% (P0.01), dNK细胞 NKG2D的表达水平与 pNK细胞相近, 分别为(8
10、8.704.1)%与(93.103.6)%, 有统计学意义(P0.05, 表 1)。表 1 外周血及蜕膜 NK细胞的含量及表型变化的比较（略）aP0.05, bP0.01 vs 外周血.2.3 正常早孕蜕膜 T淋巴与外周血中 T淋巴细胞亚型含量的比较 蜕膜中的 CD4+T淋巴细胞的表达低于外周血中 CD4+T淋巴细胞, 两者分别为（13.701.0）%与(15.852.4)%(P0.05), 蜕膜中 CD8+T淋巴细胞表达明显低于外周血中 CD8+T淋巴细胞, 两者分别为（15.231.5）%与（18.851.73）%, 有统计学意义(P0.01, 表 2)。表 2 外周血及蜕膜 T淋巴细胞含
11、量的比较（略）aP0.05, bP0.01 vs 外周血.3 讨论关于妊娠免疫的研究表明, 子宫 NK的表型和 T细胞的平衡状态与不明原因习惯性流产、 胚胎停止发育及妊高征等妊娠期并发症有关3, 需要研究早期妊娠母一胎界面免疫状态, 以及这种状态和系统免疫的关系, 以便为先兆流产及自然流产的发病机制的研究奠定基础。本研究中通过同时检测早期妊娠子宫蜕膜和外周血中 T细胞亚群、 NK细胞表型的含量, 了解正常早期妊娠母胎界面和母体外周血中 NK, T细胞的免疫状态及其相互关系。dNK 细胞是妊娠子宫中数量最多的免疫细胞, 它分布于母体与胚胎接触的蜕膜, 直接识别胎儿抗原, 推测 dNK细胞在母胎界
12、面免疫耐受中发挥重要作用。CD16 是 NK细胞细胞毒效应的标志, CD16+细胞可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应启动 NK细胞的杀伤功能, 早孕期其含量增加, 可能是母体对胎儿产生免疫排斥的结果, 当其反应过强时则可能导致流产, NK细胞杀伤活性增强可能是一些病理妊娠的发病机制之一4。本研究显示蜕膜NK主要以 CD56+CD16-(约 90%)为主, 而外周血中则以 CD56+CD16+ (约 95%)为主。同外周血 NK细胞相比, 蜕膜 NK细胞有不同的功能行为, 因为 CD16的低表达, 蜕膜 NK细胞显示出对表达 MHCI 类分子的滋养层细胞杀伤能力的下降, 提示蜕膜 NK中低表达
13、 CD16有利于妊娠过程中滋养细胞的维持。与本课题研究组前期实验结果相比, 随着妊娠月份的增加, 蜕膜 NK细胞逐渐减少, 而外周血中 NK细胞的变化并不明显。最近文献报道在鼠的模型中证实蜕膜 NK细胞是从外周血募集到蜕膜而不是由子宫黏膜自我更新的, 说.明蜕膜中的 NK细胞表型不同于外周血中, 有利于胚胎的发育, 这与本实验结果一致。胎儿免于母体 NK细胞攻击, 由于 dNK细胞高表达 NKG2受体, 此类受体家族绝大多数胞外区都有一个 C型凝集素样结构域, 因此也称为 C型凝集素受体家族5 。NKG2A 能特异性结合非经典的 HLA 类分子 HLAE, 传递抑制信号抑制 NK细胞的杀伤活性
14、。妊娠期 dNK细胞 NKG2A的表达水平为(88.75.4)%, 明显高于 pNK细胞(24.97.8)%, 由于滋养细胞表面高表达 HLAE6, 推测 dNK细胞表面的 NKG2A与滋养细胞表达的 HLAE 特异性结合, 传递抑制性信号抑制 dNK的活化, 阻止其对滋养层细胞杀伤。NKG2D对 NK细胞有较强的活化作用, 与配体结合激活 NK细胞的杀伤活性7,由于滋养层组织中并未发现其相应配体 MICA/MICB的表达8, 因此, 推测dNK细胞高表达的 NKG2D不能传递活化信号, 从而不能对滋养层细胞进行杀伤。T 细胞是执行特异性细胞免疫应答的关键细胞, 可反映机体基本细胞免疫状态,
15、人类成熟 T细胞按表型差异分 CD4+T细胞和 CD8+T细胞, 二者相互协调、 相互制约, 从而调控着机体的免疫状态。CD4+T 细胞可分泌多种细胞因子, 促进 B细胞、 T细胞和其他免疫细胞的增殖与分化, 协调免疫细胞间的相互作用, 而 CD8+T细胞又称细胞毒 T细胞, 可特异性杀伤靶细胞, 可抑制 B细胞产生抗体免疫应答, 在机体免疫调节中起主导作用9。本试验结果表明妊娠期外周血中 CD4+T、 CD8+T细胞比例高于蜕膜局部 CD4+T、 CD8+T细胞比例, 蜕膜局部 CD4+/ CD8+比值低于外周血中 CD4+/ CD8+比值, 其比值的降低, 使机体防护性免疫反应增强, 这表
16、明妊娠期母 胎界面局部的细胞免疫功能处于一定的耐受状态, 有利于胎儿免受母体免疫系统的攻击。在正常情况下, CD8+细胞数增加, CD4+/CD8+比例下降, 母胎间免疫关系的平衡表现为免疫排斥的减弱和保护性反应的增强, 从细胞免疫状态方面看, 表现为 CD8+细胞数功能增强, CD4+/CD8+比例下降, 这有利于母胎间免疫平衡的维持。总之, 妊娠是一个极其复杂的生理过程, 胎儿在母体内不被排斥与很多因素有关, 从免疫学角度推测母 胎界面处 NK细胞和 T细胞表型及含量的变化是胎儿在母体内不被排斥的重要原因之一, 但具体什么因素导致全身系统与局部系统存在此差别, 有待进一步研究。【参考文献】
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19、tors on decidual NK cellsJ. Eur J Immunol, 2000, 30(6): 1623-1631.6 Avril T, Jarousseau AC, Watier H, et al. Trophoblast cell line resistance to NK lysis mainly involves an HLA class Iindependent mechanismJ. Immunol, 1999, 162(10): 5902-5909.7 Kusumi M, Yamashita T, Fujii T, et al. Expression patter
20、ns of lectinlike natural killer receptors, inhibitory CD94/NKG2A, and activating CD94/NKG2C on decidual CD56bright natural killer cells differ from those on peripheral CD56dim natural killer cellsJ. Reprod Immunol, 2006, 70(1-2): 33-42.8 Groh V, Wu J, Yee C, et al. Tumourderived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and Tcell activationJ. Nature, 2002, 419(6908): 734-738.9 Gutenberg A, Buslei R, Fahlbusch R, et al. Immunopathology of primary hypophysitis: implications for pathogenesisJ. Am J Surg Pathol, 2005, 9(3): 329-338.
