1、第三节 基因工程育种 一. 微生物学与基因工程的关系微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。从以下六个方面可以说明：基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成。基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的。微生物细胞是基因克隆的宿主，即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体 DNA 在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中。为大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导入大肠杆菌或是酵母菌中以构建成工程菌，利用工厂发酵来实现的。微生
2、物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源。有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究中取得的，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。 二. 基因工程的特点 打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制 可进行定向变异和育种 可创造出自然界中原本没有的生物三. 基因工程的基本操作 .目的基因的取得选择目的基因的途径有 3 种：选择适宜的给体细胞,以便从中采集分离到有生产意义的目的基因；通过反转录酶的作用由 mRNA 合成 cDNA(互补 DNA)；用化学方
3、法合成特定功能的基因。.选择载体载体必须具备下列几个条件:是一个有自我复制能力的复制子;能在受体细胞内大量增殖，有较高的复制率；最好只有一个限制性内切酶的切口,使目的基因能固定地整合到载体 DNA 的一定位置上；载体上必须有一种选择性遗传标记，如具有四环素、氨苄青霉素等的抗性基因,以便及时把极少数“工程菌” 选择出来。目前，原核受体细胞的载体,主要有细菌质粒(松弛型) 和 噬菌体两类。真核细胞的载体,主要有 SV4。3.目的基因与载体 DNA 的体外重组对目的基因与载体 DNA 均采用限制性内切酶处理，从而获得互补粘性末端或人工合成粘性末端。然后把两者放在较低的温度(56) 下混合 “退火”。
4、由于每一种限制性内切酶所切断的双链 DNA 片段和粘性未端有相同的核苷酸组分,所以当两者相混时,凡粘性末端上碱 基互补的片段,就会因氢键的作用而彼此吸引, 重新形成双链,这时,在外加连接酶的作用下，供体的 DNA 片段与质粒 DNA 片段的裂口处被“缝合”，形成一个完整的有复制能力的环状重组体嵌合体。4.重组载体引入受体细胞体外反应生成的重组载体只有将其引入受体细胞后，才能使其基因扩增和表达。受体细胞可以是微生物细胞，也可以是动物或植物细胞。目前使用最广泛的是微生物细胞E.coli。其次为枯草杆菌和酿酒酵母。把重组载体 DNA 分子引入受体细胞的方法很多。若以重组质粒作载体时，可以用转化的手段
5、；若以病毒 DNA 作重组载体时,则用感染的方法。 在理想情况下,上述重组载体进入受体细胞后,能通过自主复制而得到大量扩增，从而使受体细胞表达出供体基因所提供的部分遗传性状，受体细胞就成为“工程菌”。5 .转化子的筛选和重组子的鉴定 在制备目的基因时对染色体进行了切割，产生大量的 DNA 小片断，故进入受体细胞的克隆不仅有目的基因，而且有大量不需要的基因，所获得的是含有不同克隆子的细胞群体。在 DNA 体外重组中，外源 DNA 片断与载体 DNA 的连接反应物一般不经分离直接用于转化，由于重组率和转化率不可能达到 100% 的理想极限，因此必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组子
6、的转化细胞）与非转化子，重组子（含有重组 DNA 分子的转化子）与非重组子（仅含有空载载体的转化子） ，以及期望重组子（含有目的基因的重组子）与非期望重组子（不含有目的基因的重组子） 。转化子的筛选和重组子的鉴定主要方法有：载体遗传标记法、外源基因表达产物的鉴定、重组 DNA 分子结构特征的鉴定等。四、DNA Shuffling 技术随着 PCR 技术的发展和应用，1994 年美国的 Stemmer 提出了一个全新的人工分子进化技术-DNA Shuffling(又称洗牌技术)，该技术能模拟生物在数百万年间发生的分子进化过程，并可在短的实验循环中定向筛选出特定基因编码的酶蛋白活性提高几百倍甚至上
7、万倍的功能性突变基因。其基本原理是先将来源不同但功能相同的一组同源基因，用 DNA 核酸酶 I 进行消化产生随机小片段，由这些随机小片段组成一个文库，使之互为引物和模板，进行 PCR 扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板转换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作新一轮的体外重组。一般通过 2-3 次循环，可获得产物大幅度提高的重组突变体。例如，1998 年 Andreas 等用 4 个不同来源的先锋霉素基因混合进行 DNA shuffling，仅单一循环获得的该抗生素，最低抑制活性(MIC)就提高了270540 倍。基本步骤如下图所示：(1)用 DNase I 消化功能相同的一组基因片段(A)，从而产生随机小片段(B)。(2)经提纯后，用无引物(经变性后可互为引物)的类似 PCR 反应重新装配这些小片段成完整长度的重组基因片段(C)，在装记过程中被证明有低水平点突变产生。(3)克隆并选择正突变体(D)，并将正突变体的重组基因片段作新一轮的体外重组。图 Shuffling 技术
