1、1组织谷氨酰胺酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途组织谷氨酰胺酶（glutaminase）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶的酶偶联反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）还原后吸光峰值的增高，即采用光度法来测定组织裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体、昆虫等）谷氨酰胺酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景谷氨酰胺酶（glutaminase；EC3.5.1.2）是一种氨基酸水解酶（amidohydrolase ） ，将谷氨酰胺脱氨基（de
2、aminating）转化为谷氨酸。其同工酶具有组织特异性：其功能在肝细胞中产生的氨，用于合成尿素；在肾小管上皮细胞中产生的氨通过氨离子分泌，调节肾的酸碱平衡；同时在胶质细胞（glial cell）和肠细胞中也有表达。谷氨酰胺酶在药物和食品工业方面应用广泛，例如调味品的生产和白血病治疗的药物等。基于底物谷氨酰胺在谷氨酰胺酶酶的作用下，转化为谷氨酸和氨气，进而在谷氨酸脱氢酶的催化下，伴随着氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD ）转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenin
3、e dinucleotide；NADH） ，产生的吸光峰值的变化（340nm 波长），来定量分析谷氨酰胺酶的活性。其酶偶联反应系统为：产品内容清理液（Reagent A） 毫升裂解液（Reagent B） 毫升反应液（Reagent C） 毫升终止液（Reagent D） 微升缓冲液（Reagent E） 毫升酶促液（Reagent F） 微升底物液（Reagent G） 毫升产品说明书 1 份保存方式保存 裂解液（Reagent B） 、 缓冲液（ Reagent E） 、 酶促液（Reagent F）和 底物液（Reagent G）在20冰箱里；其余的保存在 4冰箱里； 底物液（Reage
4、nt G）避免光照； 终止液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证 6 月用户自备21.5 毫升离心管：用于样品操作的容器15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器（微型）台式离心机：用于样品操作培养箱：用于反应孵育比色皿或 96 孔板：用于光度分析的容器分光光度仪或酶标仪：用于光度分析实验步骤实验开始前，将20冰箱里的试剂盒中的 裂解液（Reagent B） 置入冰槽里融化。然后进行下列操作。一、样品准备1 手术取出动物组织，并秤重以确定 500 毫克组织重量 2 （选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管3 （选择步骤）加入 xx 毫升 清理液（Reagent A）清洗
5、1 次4 移入到一个液氮冻存管5 即刻放进液氮罐过夜6 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意： 切莫使组织冻融 ）7 放进一个 15 毫升锥形离心管8 加入预冷的 xx 微升 裂解液（Reagent B） 9 转移到预冷的 1.5 毫升离心管10强力涡旋震荡 30 秒，充分混匀11置于冰槽里孵育 30 分钟，期间每 10 分钟强力涡旋震荡 30 秒（注意： 如需暂时停止，放进 70 冰箱里储存备用 ）12放进 4微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）13小心移取 500 微升上清液到新的预冷的
6、 1.5 毫升离心管14移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意： 建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 HL30030.1）15即刻放进70保存或置于冰槽里继续后续操作二、测定准备1 开启并设定好分光光度仪（温度为 37）：波长 340nm，并置零 2 从20冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化； 底物液（Reagent G）避免光照三、样品背景对照测定1 移取 xx 微升 反应液（Reagent C）到新的 1.5 毫升离心管2 加入 10 微升 95预处理 15 分钟后再预冷的的待测样品（20 微克蛋白） ，混匀3 在 37温度下孵育 30 分钟4 加入 xx 微升 终止液（Reag
7、ent D） ，混匀5 置于冰槽里备用，标记为阴性反应液6 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent E）到新的比色皿7 加入 xx 微升 酶促液（Reagent F）38 加入 xx 微升 底物液（Reagent G） 9 上下倾倒数次，混匀10在 37温度下孵育 3 分钟11加入 xx 微升上述冰槽里备用的阴性反应液12在 37温度下孵育 30 分钟13即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照 四、样品测定1 移取 xx 微升 反应液（Reagent C）到新的 1.5 毫升离心管2 加入 10 微升待测样品（20 微克蛋白） （注意： 样品须清澈 ） ，混匀3 在 37温度下孵育 30 分
8、钟4 加入 xx 微升 终止液（Reagent D） ，混匀5 置于冰槽里备用，标记为样品反应液6 移取 xx 微升 缓冲液（Reagent E）到新的比色皿7 加入 xx 微升 酶促液（Reagent F）8 加入 xx 微升 底物液（Reagent G） 9 上下倾倒数次，混匀10在 37温度下孵育 3 分钟11加入 110 微升上述冰槽里备用的样品反应液12在 37温度下孵育 30 分钟13即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数 五、计算样品活性注意事项1 本产品为 20 次操作2 操作时，须戴手套3 样品须澄清，至关重要 4 光度测定后，比色皿须清洗彻底5 样本读数高于背景读数表明具有酶活性6 建议待测样本蛋白浓度为 20 微克/10 微升；如果样本酶活性过低或过高， 则可以增加或降低样本量（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 HL30030.1） 7 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度8 谷氨酰胺酶单位活性定义为：在 37，pH 8.6 条件下，每分钟内能够转化 1 微摩尔谷氨酰胺至谷氨酸所需的酶量作为一个活性单位9 本公司提供系列谷氨酰胺酶检测试剂产品质量标准1 本产品经鉴定性能稳定2 本产品经鉴定检测敏感4
