1、,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,受体研究技术Techniques in receptor research,主要参考书: 受体研究技术 主编:贺师鹏, 胡雅儿, 夏宗勤 2004年4月第一版,课件地址:生物物理学系生物大分子复合物实验室: http:/ Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,第六章 受体放射配基结合分析的基本方法,韦日生北京大学医学部生物物理学系2006年6月,Dept.of Biop
2、hysics, Peking University School of Basic Medical science,放射性核素的几个基本概念,放射性配基的制备,受体标本的制备,放射配基结合反应,受体分析的数据处理,RBA主要内容,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,放射性核素的几个基本概念,*核衰变: 放射线核素自发地发生核内成分或者能态的改变而转变为另一种核素,同时释放出一种或者几种以上的射线,这个变化过程称为放射性核衰变,简称为核衰变.,衰变 -衰变 +衰变 电子俘获(EC)衰变 跃迁,
3、五种衰变方式,衰变规律: N= No e -t,N0为t0时放射性核素的原子核总数 为衰变常数：即每一放射性原子核在单位时间内发生衰变的几率,射线射程短,穿透力弱,无需设置屏障;低能-射线射程短,无需设置屏障,如3H; 高能-射线一般用中等密度材料如玻璃做屏障; 射线能量高,穿透力强,需要密度大材料如铅,铁,水泥等做屏蔽.,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,半衰期 T1/2：指放射性核素的原子核数目减少一半所需的时间,根据衰变公式：当t= T1/2时, N=N0/2 = No e -T1/
4、2 T1/2=ln2/ =0.693/ ,常见几种医用放射性核素的半衰期,T1/2 = 0.693/ ,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,*放射性活度()：单位时间内核的衰变数,A=dN / dt A=A0 e -t A= N= 0.693/T1/2 N,放射性活度单位及其换算：dps, Bq , Ci,1Ci =1 103 mCi = 1 106 Ci = 3.7 1010 Bq =37GBq=3.71010dps = 2.221012 dpm,1Bq为放射性核素在1秒内发生1次核衰变,
5、 1Bq=1dps,单位用dps表示: 即每秒衰变次数(Disintegrations Per Second ) ,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,放射性比活度 : 指单位质量放射性物质的放射性活度可用mCi/mg ，Bq/mg 表示也可用每毫摩尔分子所含的放射性活度表示mCi/mmol ，Bq/mmol,每mol放射性活度为: A= 0.693/T1/2 1 6.022 1023 TBq (1Bq=1dps)T1/2: 单位 秒; dps: 每秒衰变次数 1 dps60 = 1dpm1
6、Ci = 3.71010Bq = 2.221012 dpm=3.71010dps,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,放射性比活度计算举例：,核反应生产的 32(T1/2=14.28天，原子量=32) 那么：每mol放射性活度为:,A=,1 6.022 1023,= 3.38 1017 dps = 3.38 1017 Bq,每克放射性活度为:A= 3.38 1017 /32=1.05 1016Bq,Dept.of Biophysics, Peking University School of
7、 Basic Medical science,第六章 受体放射配基结合分析的基本方法,第一节 放射性配基的制备,一 放射性配基的基本性质和选择,放射性配基的基本要求,比活度高 亲和力高 特异性高 稳定性好,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,比活度高,*低比活度标记配基难于达到分析灵敏度的要求。组织细胞内的受体浓度一般都很低，约在104-105个/细胞，受体的平衡解离常数多在0.110nmol/L间。故一般要求放射配基比活度至少为3.71011Bq (10Ci)/mmol。*另外，放射性配基
8、比活度高，加入反应管的放射性配基的化学量就可减少，有利于降低非特异性结合。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,亲和力高,*如果配基和受体的亲和力较低，必须用较多的配基才能达到基本饱和，不仅会提高非特异结合，而且费用会大大增加。*此外，亲和力高则配基与受体的复合物解离就慢，可进行有效的结合和游离标记配基的分离，有利于减少实验误差。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,特异性高,一般都应选择
9、专一性高的标记配基。如果配基与受体结合的特异性不高，可能与其它受体有交叉结合，影响结果的可靠性，有时甚至必须用一定方法抑制交叉结合才能得到可信的结果。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,稳定性好,所谓稳定性好有两重含义:首先是标记原子引入配基分子应当不影响配基的性质，也就是标记配基能代表非标记配基.其次，标记的配基应当稳定性好，还应定期考察标记配基贮藏过程中的辐射自分解，需要时进行纯化。比活度太高的3H标记配基容易发生辐射自分解，应当根据工作需要,在要求的灵敏度和减少辐射自分解之间进行合理
10、的选择,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,2 具体工作中标记配基的选择,根据研究对象和研究目的综合考虑,例如:(1)对同一种受体的不同亚型，有的配基有选择性，有的没有选择性，如果实验目的是测定总的受体，应当选没有选择性的标记配基。如果要分别测定不同亚型，则应考虑用选择性标记配基。(2)标记配基有水溶性和脂溶性之分，如果测定完整细胞表面的受体，应当选用水溶性标记配基，以减少因配基进入胞浆引起的误差。,Dept.of Biophysics, Peking University School o
11、f Basic Medical science,二 125I标记放射性配基的制备,受体放射分析中常用的放射性核素是3H和125I。 3H标记配基一般都是商品，普通实验室不能自行制备。 此处主要介绍125I标记多肽或蛋白的技术.,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,125I标记放射性配基,*凡是多肽或蛋白中含有酪氨酸残基的都可引入放射性碘.*最常用的核素是125I，它的半衰期为60.2天，最大的放射性比活度为2175Ci/mmol，以核外电子俘获的方式衰变，主要发射低能量X和 线。*蛋白质的碘
12、标技术比较成熟，操作简便，一般生物学工作者均可自行操作。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,*避免氧化剂引起配基结合活性和生物活性丢失的问题碘标记技术是利用氧化剂将负碘离子氧化为碘分子，碘分子自行分裂成正碘和负碘离子，正碘离子便置换酪氨酸分子中酚羟基邻位氢而生成放射性碘标记的酪氨酸残基。 最常用的氧化剂是氯胺-T, 乳过氧气化物酶-过氧化氢，氯甘脲 (Iodogen) 等三种 配基结合活性和生物活性丢失主要的原因是多肽分子中的甲硫氨酸、半胱氨酸对氧化剂十分敏感，使甲硫氨酸中的硫原子氧化成亚
13、砜基团，半胱氨酸则可能形成二硫键。,(一) 125I标记放射性配基的几个共同性问题,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,* 碘标记位置不同对配基结合活性和亲和力的影响,利用放射性碘标记多肽或蛋白分子属于非同位素标记，酪氨酸残基酚羟基邻位有两个氢原子都可被置换，生成一碘标记物，双碘标记物，往往一碘标记物是有效的，双碘标记物无效.,一个多肽分子可能存在一个以上的酪氨酸残基，不同位置的酪氨酸残基它的配基结合亲和性是不同的，例如：胰高血糖素（glucagon）虽都是一碘标记物，但因碘标位置不同，不但
14、结合活性不一样，而且亲和力也不同，125I-Tyr13-标记物和125I-Tyr10-标记物对肝细胞受体的Kd值分别是1.3nmol/L和0.3nmol/L，两者相差四倍。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,* 碘标记后由于标记配基衰变造成配基结合活性的改变,对受体的测定来说，由于要依靠标记配基的比活度来计算受体的数量和亲和力，所以配基的比活度必需准确标定. 对125I标记的配基，需要考虑储存引起的衰变以及衰变后是否仍有和受体结合的活性。有些标记配基衰变可能导致化合物某些键的断裂，结果衰变
15、产物失去和受体结合的能力，如某些小分子标记配基。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,(二) 几种常用的碘标技术,* 氯胺-T法* Iodogen法 * 乳过氧化物酶法 * 偶联标记法,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,氯胺-T 法,氯胺-T的化学名称为N-氯代甲苯磺酰胺钠盐,迄今仍然是实验室最常用的碘化方法之一。,氧化原理:,氯胺-T 次氯酸,水解,碘阴离子,氧化,碘分子,负碘离子,正
16、碘离子,裂解,与酪氨酸分子中酚基邻位氢置换,生成放射性碘标记的酪氨酸残基,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,氯胺-T法 (N-氯代甲苯磺酰胺钠盐 ),注意事项,1 氧化剂的用量 如理论上氧化1 mCi (0.46纳克原子数) 无载体，无保护剂的Na125I理论上只要用0.075g氯胺-T. 实际用量都要大.过量的氯胺-T使反应彻底快速完成，其次如果碘源含保护剂(Na2SO3)，还要加35倍的氯胺-T氧化还原剂. 所以氯胺-T用量为10-20g比较合适 .,Dept.of Biophysic
17、s, Peking University School of Basic Medical science,2 碘化反应完成后，还需加1.52倍的还原剂偏重亚硫酸钠 (Na2S2O5) 中和多余的氯氨-T。 3 标记蛋白的用量一般是120g，碘化反应的体积控制在0.1ml之内，反应时间为1min左右。 4 蛋白质中含有甲硫氨酸，半胱氨酸对氧化剂敏感 ,要减少氯胺-T的用量和缩短作用时间.,注意事项,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,Iodogen法,Iodogen商品名为氯甘脲，化学名1,3
18、,4,6-四氯3,6-二苯-甘脲，它与氯胺-T同属氯酰胺类，也是氧化剂，氧化作用中等，不溶于水，可溶于二氯甲烷等有机溶剂中，将其溶液涂布于试管表面，干后形成固相氧化剂，碘化反应就在涂有固相氧化剂的试管内进行. Iodogen用量在10-20g左右，反应时间长短视不同蛋白质而定，一般在15min之间，碘化反应完毕吸出反应混合物，反应即终止。主要优点是对蛋白质损伤小, 它不用还原剂，不存在因还原剂引起对蛋白质中二硫键的破坏。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,乳过氧化物酶法,乳过氧化物酶 (L
19、PO) 在本法中用作催化剂，它和过氧化氢作用，生成新生态氧，使负碘离子氧化成分子碘，最后形成正碘离子，置换蛋白质中酪氨酸残基中酚羟基邻位的氢。,在反应中，乳过氧化物酶用量极少，仅为标记配基1% 的量，以减少酶自身碘化而引入放化杂质。过氧化氢的用量也很少，起始加入50-100ng，以后每隔10-15min补加过氧化氢 (30ng-50ng) 一次，共4次左右，最后用硫基乙醇终止反应。本法也比较温和，但操作比较麻烦，现在多数已被Iodogen法取代。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,偶联标记
20、法,又称简接标记法，或Bolton-Hunter法。如果待标记的配基不含酪氨酸残基，上述三种方法将有困难，可以考虑采用偶联标记法。,以氯胺-T法制备碘标记的3,5-(4-羟基苯)-丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯 (HPNS)，然后与蛋白质中的游离氨基缩合，生成含放射性碘的蛋白质或多肽配基.,上面是125I标记的HPNS. 下面是125I标记HPNS脱去羟基琥珀酰亚胺基，连接到多肽链的末端游离氨基，形成氨基末端加125I标记3-(4-羟基苯)-丙酸的标记多肽.,125I -HPNS,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medica
21、l science,三 放射性配基的质量鉴定,1. 放射化学纯度:,放射性配基的放射化学纯度对受体结合率及分析灵敏度均有较大影响。除新鲜制备的产品外，存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在95以上。,2. 结合活性的鉴定 :,受体结合分析中，放射性配基和受体的结合活性特别重要。目前，测定配基的活性主要是指与受体的结合能力（bindability）, 即测定其最大结合%, 理论上应为100%。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,结合活性的测量方法
22、(JC Kermode 提出):,以定量标记配基加逐级增加至过量的受体制剂进行反应，测定结合百分率。 以结合百分率的倒数对受体浓度的倒数作图，获得一条直线。 延长直线与纵座标的交点，即可算出该标记配基结合活性。,左图: 标记配基结合活性测定示意图. 交点值为1.14, 结合活性=1/1.14=88.7%,1,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,3. 放射性配基比活度的测定,*受体结合分析结果的计算离不开准确的比活度数据。 *从配基的比活度算出复合物的比活度，然后复合物的放射性活度除以该比活度
23、，算出受体的分子数。 *测定配基的比活度，关键是准确测定配基的化学量, 目前,商品化的标记配基, 放射活度和化学量的定量都很精确,通常不需要在实验室再测定.,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,第二节 受体标本的制备,一 组织切片,第一种方法先体内给放射性配基进行结合反应后取组织切片 第二种方法先取进行切片再进行结合反应,整体注射放射配基,在位灌流固定,取出脏器常规切片,大体、光镜或电镜自显影,组织切片整体给放射配基的操作流程图,新鲜组织冰冻切片,离体放射配基结合反应,大体或光镜自显影,常规
24、超薄切片,电镜自显影,组织切片离体给放射配基的操作流程图,多聚甲醛,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,二 完整活细胞,*用细胞悬液进行反应,制备细胞悬液,试管内进行放射配基结合反应,收集细胞,测量放射性,直接向贴壁细胞加放射配基进行结合反应,收集细胞,测量放射性,需要注意的问题,*每个培养瓶或培养孔的细胞数应相同,*少数培养瓶或培养孔可不加放射配基供细胞定量用,蛋白定量,细胞记数.,*细胞收集方法,酶消化,细胞收集器等,*要有一定数量的培养瓶做非特异结合,*用贴壁细胞进行反应,需要注意的问
25、题: 结果以每105或106细胞的受体数表示, 注意保证受体完好无损,抽滤法,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,三 亚细胞组分的差速离心法分离,细胞的质膜,胞浆,胞核有很多蛋白受体, 打碎成匀浆后，不同的受体就有不同的密度，在一定的介质中它们的沉降速度不同，用差速离心法可以将它们分离.,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,亚细胞组分制备中的要注意的几个具体问题,1 去除内源性配基及蛋白水
26、解酶,要用含蛋白水解酶抑制剂的离心缓冲液介质溶解标本, 反复离心 (40000g, 1530min)，3次以上, 弃上清, 收集沉淀即可.,常用于受体放射配基测定介质中的蛋白水解酶抑制剂,2 受体标本的保存,一般标本的匀浆(除结合反应外)都在0-4下操作, -70保存, 一般能保存半年.,这种方法最常用于膜制剂，所以也称为洗膜法。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,3 受体蛋白从膜结构或核中溶脱成为可溶性受体蛋白,一般来说核受体主要用高浓度KCl，膜受体主要用表面活性剂(去垢剂) 溶解,
27、通过离心和冷冻浓缩, 获得纯度教高的蛋白.,几种溶脱剂的使用方法,4 受体蛋白的进一步纯化,常用的亲合层析,离子交换层析, 高效液相色谱等技术,主要用来分析受体的结构、结构和功能的关系,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,第三节 放射配基结合反应,针对不同的实验目的，放射配基结合反应有多种类型,单纯求受体密度,同时求受体密度和亲和力,可用选择性放射配基做多点饱和分析;也可用无选择性的放射配基和有选择性的非标记配基作多点竞争结合分析。,用单点结合分析,需要用多点饱和分析,求不同亚型的受体密度和
28、亲和力,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,放射配基结合反应的一些共同问题,1 反应介质,*放射配基结合分析尽量模拟生理条件，以达到高的结合率 .,*常见缓冲液有:磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液等 , pH7.47.8,*制备受体标本的缓冲液时通常要加一些附加成分:附加成分中的蔗糖0.25mol/L对一些结合反应没有影响，制备缓冲液和反应缓冲液合二为一使用。儿茶酚胺类的受体容易氧化失活，制备标本和反应时都应含还原剂如维生素C。,Dept.of Biophysics,
29、Peking University School of Basic Medical science,钠、镁等离子在不同的受体系统中会有不同的影响，需根据具体目的决定选用与否。易被蛋白水解酶破坏的受体系统制备标本时需加蛋白酶抑制剂，反应缓冲液也应含蛋白酶抑制剂，但需注意有些蛋白酶抑制剂有抑制某些受体系统特异性结合的作用，应当设法避免。受体蛋白的反应终浓度最好在0.1mg/ml以上，蛋白量过少可能因管壁的吸附作用而影响结果的准确性.,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,2 标记配基浓度,标记配基
30、浓度的选择, 一般来说，应当兼顾两个方面: 一是在同一实验中放射性最低的一点应能满足测量统计学的要求.二是放射配基的用量应尽可能低，使非特异结合不致太高，而且整个实验的费用控制在能承受的范围内. 标记配基浓度一般选择在0.110倍Kd间.,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,3 测量非特异结合的非标记配基浓度,特异结合=总结合-非特异结合,非特异结合通常都用平行管测定，该管反应体积、孵育条件、分离条件、受体浓度、放射配基浓度都和总结合管完全相同.非特异结合管含有较大量的非标记配基，结果特异结
31、合完全被抑制，于是测得的放射性就代表非特异结合。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,测量非特异结合的非标记配基浓度方法:,向反应系统中逐步增加测定非特异结合的非放射性配基浓度, 可以得到如图所示的曲线.图中低浓度时只有部分特意结合被抑制，随浓度增加而抑制逐步显著 (图中A段). 到达一定浓度时为一个平段.该平段表示特异结合已完全被抑制(图中B段). 如果继续加大非放射性配基浓度，则非特异结合也将被抑制, 平段又开始下降 (图中C段)。,用于非特异结合测定的非标记配基浓度的合理选择应是平段的
32、浓度, 应当选择B区.,通常非放射性配基的浓度是放射形配基浓度的1000倍,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,非特异结合是高容量、低亲和力结合，不易饱和，如各管所加LT不同，则非特异结合通常和LT的量呈线性关系，在普通坐标上呈一逐步上升的直线。据此，实际工作中不需要每一不同剂量的LT都做平行的非特异结合管，只需总共做3点，通过直线回归即可求出任何LT时的非特异结合。,非特异结合特点:,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic
33、 Medical science,4 受体浓度,在一定的受体蛋白浓度范围内特异性结合量与受体浓度成线性关系, 在线性范围内，较高受体浓度将增加特异性结合与非特异性结合的比值。一般建议，受体浓度应大于Kd值。(最好在0.1mg/ml以上),Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,5 孵育温度与时间,孵育温度是影响反应速率的重要因素。温度高，结合快，达到反应平衡时间短。温度低，反应终止可减少分离过程中复合物的解离。对于饱和或竞争抑制试验，应要求反应达到平衡，故孵育时间应足够长以达到平衡状态。对于多点
34、法的实验，配基浓度低的所需平衡时间较长，在测试最佳孵育时间时，应当用浓度最低一点的放射性配基。 不同的受体结合系统的反应平衡时间因亲和力、孵育温度、配基及受体浓度的不同而不同 ,最佳孵育温度要经过试验选定. 一般选37 和4,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,6 结合与游离配基的分离,受体配基结合分析最终以测定复合物的放射性来求解受体的数量与平衡解离常数.因此在反应达到平衡后将结合部分和游离部分配基分开.,对分离方法有两个基本要求：一是分离必须尽量完全，也就是既完全或接近完全地除去游离放射
35、配基，又完全或接近完全地保留复合物 .二分离方法还要简易可行，在分离时间，分离温度等方面可以保持各样品管之间的一致性，以减少分离过程造成的额外误差。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,常用的分离方法有离心法、抽滤法、吸附法、透析法、电泳法等。分离方法的理论依据是在一定温度下复合物的解离速率和平衡解离常数Kd相关。Kd大则解离快, 所以越是亲和力低的受体，要求分离方法越是能快速完成。,容许分离时间是指不超过10%解离的最大分离时间,Dept.of Biophysics, Peking Uni
36、versity School of Basic Medical science,1 抽滤法 (滤膜法),主要用于颗粒状的受体标本如完整细胞、膜受体、核受体。滤膜材料的要求: 能阻挡复合物而又不过多地产生对标记配基的非特异性吸附.常用的滤膜有: 玻璃纤维滤膜 , Whatman GF/B滤膜, GF-32滤膜等.抽滤系统包括: 抽滤水泵 抽滤头 细胞收集器,抽滤过程: 反应介质冷却, 抽滤, 滤膜用冰冷缓冲液冲洗, 取出滤膜,如是125I标记物，立即可以测量，3H标记物则需烤干后投入闪烁液作固相液体闪烁测量。,Dept.of Biophysics, Peking University Schoo
37、l of Basic Medical science,如何减少游离标记配基吸附在滤膜上 : (减少非特异性结合 ),滤膜预先用较高浓度的非标记配基浸泡，使滤膜吸附大量非标记配基，以减少标记配基吸附. 如果标记配基是多肽或蛋白质, 用0.11白蛋白预先浸泡滤膜有时可明显减少标记配基的吸附。 用0.1PEI（polyethyleneimine 聚乙烯亚胺）预先浸泡滤膜，可以显著阻断某些品种游离配基的结合。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,2 离心法,适用于颗粒性样品(如完整细胞、膜受体、核受
38、体),*在反应结束后，低温离心 (离心力和制备时相同)，收集沉淀。 *对于低亲和力的样品,离心后立即测量，则游离和结合部分的平衡并未破坏 。(非特异结合较高 ) *对高亲和力受体，因为解离较慢，可以用不含放射配基的缓冲液反复离心23次，以降低非特异结合.,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,3 吸附法,本法适用于可溶性受体的复合物. 即用某种吸附剂加到反应液中, 将游离配基吸附后离心或过滤除去, 取上清液测量放射性. 常见的吸附剂有右旋糖酐加膜活性炭 (dextran-coated char
39、coal, DCC) 、活性炭、滑石粉、羟磷灰石等。,4 柱层析分离法,本法主要是用葡聚糖凝胶 (Sephadex或Sepharose) (凝胶过滤法 )装柱，反应缓冲液平衡后加入样品，然后用同一缓冲液洗脱，可得到两个放射性峰，第一峰就是复合物的位置。 总结合管的第一峰放射性减去平行非特异结合管的第一峰放射性即为特异结合的放射性。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,5 低亲和力受体的特殊分离方法,低亲和力受体: 指Kd值等于或大于10-8mol/L.,常用的方法有: *离心法 : 非特异性
40、结合高 *平衡透析法 *平衡柱法,平衡透析法: 将受体制剂放在透析袋, 放射配基则在透析袋内外浓度相同,平衡时，袋内的放射性因有复合物而高出袋外.如果平行的标本加有非标记配基，则复合物的放射性减少，袋内外的差异也就减少, 由此可算出特异结合的量。必须有较大量的标本才能进行一次实验。,基本原理是，创造一个环境，使分离复合物和游离配基，两者仍处于平衡状态，也就是不破坏原来的平衡。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,平衡柱法:,和普通的凝胶分离相比，只是过柱之前用含标记配基的缓冲液平衡，洗脱时也
41、用含放射配基的缓冲液, 结果则也是收集第一峰测放射性。由于排除了其它各管洗脱液的游离标记配基，所以灵敏度比平衡透析法明显提高。此法的非特异结合仍比普通高亲和力受体的凝胶分离法高很多.,3H-bepridil和受体CaM（钙调蛋白）的结合, sephadex G50柱分离. 左图是3H-bepridil在各收集管中的分布，右图是CaM浓度的分布。实际计算时26管合并，排除了其它各管的非特异结合。CaM由牛脑提取并经一定程度纯化。实测Kd 2.5210-6mol/L,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical scie
42、nce,第四节 受体分析的数据处理,一 样品的放射性和受体密度,1 样品中受体的克分子数 (摩尔数),每mol放射性活度为 A= 0.693/T1/2 1 6.022 1023 TBq (dps 60 = dpm),T1/2: 单位 秒; dps: 每秒衰变次数(Disintegrations Per Second ),1Ci =2.221012 dpm = 37GBq 复合物配基和受体的克分子比通常为 1:1,E = cpm / dpm dpm / mmol 1,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical sci
43、ence,测量效率: 放射性粒子进入探测器后可能被记录的几率(E). 测量到的样品记数率n正比于衰变率A 即n=AE,测量效率,=标本放射性活度,测量效率的测定: 将一定量的标记配基(dpm)均匀点在玻璃纤维滤膜上,烘干后,放在闪烁液中测量(cpm).,E= cpm / dpm,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,例如: 地塞米松 S.A=50Ci (1.85TBq)/mmol=1.11 108 dpm/nmol TB=3000cpm, NSB=1000cpm, 测量效率E=30%,样品中R
44、L的放射性=3000-1000=2000cpm=2000/0.3=6670dpm 受体的摩尔数: =6670 / 1.11 108 =6 10-5 nmol 受体结合位点RT=RL= 6 10-5 nmol/样品,2 样品中受体的密度,*对完整细胞来说就是一定细胞数中的受体克分子数. *对亚细胞组分或蛋白,以每mg总蛋白中有多少受体克分子数来计算.,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,针对不同的实验目的，放射配基结合反应有多种类型,单纯求受体密度,同时求受体密度和亲和力,可用选择性放射配基做
45、多点饱和分析;也可用无选择性的放射配基和有选择性的非标记配基作多点竞争结合分析。,用单点结合分析,需要用多点饱和分析,求不同亚型的受体密度和亲和力,第五节 几种常用受体配基结合反应的基本方法,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,一 单点法测量受体密度,单点法不是指标本中只有一种受体结合位点，而是指只用一种配基浓度来完成一次测量。它实际测到的是受体数总数, 不能区分不同的亚型.,适用于两种情况：*一种是标本中只有一种亚型，或者其它亚型对所用标记配基亲和力非常低 .*另一种情况是虽然标本中有不止
46、一种亚型，但所用的标记配基无选择性，因此测定的结果是各亚型的总受体数.,第五节 几种常用受体配基结合反应的基本方法,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,单点法标记配基浓度选择:单点法的标记配基浓度必须选在饱和区,一般是通过多点饱和结合实验来选定 ,在接近坪区选择配基浓度 .,本法操作简便，所需材料较少，结果可信，适用于很多只需求受体密度的场合。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,单点法数
47、据处理举例: 地塞米松 S.A=50Ci (1.85TBq)/mmol=1.11 108 dpm/nmol TB=3000cpm, NSB=1000cpm, 测量效率E=30% 样品中RL的放射性=3000-1000=2000cpm=2000/0.3=6670dpm 受体的摩尔数: =6670 / 1.11 108 =6 10-5 nmol 受体结合位点RT=RL= 6 10-5 nmol/样品,单点法的数据处理:,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,二 单点法作受体放射自显影观察受体的组织
48、分布,对放射配基的要求和上述单点法结合反应基本相同,属于半定量.,利用计算机图象分析仪，可以很清晰地对密度高低作比较.,大鼠脑切片M受体的放射自显影图. 配基为3H-QNB,右侧不同颜色 的小方块是伪彩代表的灰度刻度，从红色往下至白色表示相对灰度由深变浅,青年、老年、老年用知母水煎剂的大鼠M受体分布的比较,青年 老年 老年用知母水煎剂,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,三 简单单位点多点饱和结合实验求受体的密度和亲和力 (不区分亚型),*简单单位点多点饱和结合实验主要求受体的密度和亲和力.*基本方法和单点法相似，配基的选择应当对亚型没有选择性，或者标本本身只有一种亚型。*配基浓度应在0.110 KD范围内经过预实验加以挑选，覆盖非饱和区和饱和区。*标本制备、非标记配基的选择、反应条件和时间的选择、分离方法的选择都按第二节和第三节中的原则进行。*通常每一标本需要68个总结合和34个非特异结合点,得到各点的cpm数和受体标本中的蛋白含量。*实验操作就基本完成，可以进入数据处理。,Dept.of Biophysics, Peking University School of Basic Medical science,
