1、i 肺癌患者 的 EGFR 基因突变 检测 说明 第 1.0 版 2009 年 3 月 6 日 第 1.5 版 2009 年 3 月 23 日 第 1.6 版 2009 年 4 月 8 日 第 1.7 版 2009 年 5 月 11 日 日本肺癌学会 EGFR 说明编撰 委员会 光富 徹 哉 谷田部恭 萩原弘一 弦间 昭 彦 西尾和人 秋田弘俊 中川和彦 目录 初版序言 . ii 前言 . iii EGFR 的信号传导（图 1） iii 小分子 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂 iv EGFR 基因突变 . iv EGFR 基因突变和 EGFR-TKI 敏感性 v EGFR-TKI 的临床试验和 E
2、GFR 基因突变 vii EGFR 基因检测的种类及其特点 . viii EGFR 基因检测使用的临床样本及其处理 x 医疗保险诊疗方面的注意事项 . xii 质量保证 xiii EGFR-TKI 的其它效果预测因子 . xiii 结语 实际 诊疗和 EGFR 突变 xiv 文献 xv ii 初版序言 表 皮 生 长因子受体（ EGFR： Epidermal Growth Factor Receptor） 是 一种 跨膜受体酪氨酸激酶， 一般认为 该 酪氨酸激酶 区域 的 激活 即 磷酸化 对 癌细胞增殖、 生长 的 相关 信 号 传递 很重要 。基于 这个观点， EGFR 作为癌症治疗 的
3、分子靶标 受到普遍关注 ， 并陆续开发 出 了 EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（ EGFR-TKI）和抗 EGFR 抗体等。 2002 年 7 月 ，日本 率先批准了 EGFR-TKI 制剂 之一的吉非替尼（ Gefitinib） ， 2007 年 10月， 疗效相似的 制剂 埃罗替尼（ Erlotinib）也 通过审批 。 2009 年 4 月至今，使用 EGFR-TKI 制剂治疗非小细胞肺癌的患者 人 数已超过 8 万 5 千人。 在 所 经历 的 包括 腺癌、非吸烟者 在内显示出 神奇 效果的 病例 中 ， EGFR 基因突变 是最重要的 科学 性 效果预测因子 ， 这一点 至少 被 包括
4、日本 在内的 亚洲 国家 所 认识 。在这样的背景下， 2007 年 6 月 EGFR 基因突变 检测 被纳入了保险条例，但是，并没有对 本 检测 的实际情况进行 分析说明 。 在 2009 年 2 月 26 日召开的日本肺癌 学会理事会会议上， 光富徹哉理事 提议 编撰 “ 肺癌患者 的 EGFR 基因突变 检测 说明 ” ， 通过 后，仅 1 个多月就完成了本说明。这也是以光富徹哉理事为 核心 的 7 名 EGFR 说明编撰 委员付出 的 巨大 劳动成果，在此 谨 对他们表示深 深 的敬意和谢意 。本 文 不仅对 EGFR 基因突变 检测 进行了 分析说明 ， 而且 还对 EGFR-TKI
5、 的临床试验结果和基础性 的 新 知识 及见解 等进行 了 解读， 希望对肺癌治疗 医生 以及更多的 医疗 相关工作者有所帮助。 日本肺癌学会理事会 一濑幸人 iii 前言 吉非替尼（易瑞沙 ）是一种 表皮 生长 因子受体（ EGFR） 的 特异性 酪氨酸 激酶 抑制剂（ TKI） ，在历经 5 年半的 临床试验 后 于 2002 年夏被 批准 ， 2007 年末埃罗替尼（特罗凯 ） 也 通过审批 。 这些药物 常常 给 化疗 失效 患者 带来 神奇 的 临床 治疗 效果 及 病灶 的改善 。 2004 年春，发现了 肺癌 的 EGFR 基因突变， 以此为契机 EGFR-TKI 的研发 实现
6、了跨越性的发展 1,2） 。 我们的理解虽说不能堪称完美， 但 我们认为 EGFR 基因突变的存在 对 使用 EHFR-TKI 受益的 患者 的选择 十分有用 ，尤其对我国的肺癌研究者来说， 在这一观点上 基本 达成了 共识 。 EGFR 基因 检测 虽被纳入医疗保险，但 有关 该 检测 的 实际 情况是 各地区、各医院、各 主治医生分散地实施 。该指南 以 当今 的 知识和见解 为基 础 对实际的 检测 进行了 分析 说明 。 EGFR 的信 号 传导 （图 1） EGFR是 HER家族 的 4个 受体 成员之一 ， 由 EGFR/HER1/erbB1、 HER2/neu/erbB2、 HE
7、R3/erbB3以及 HER4/erbB4四 个分子构成。 众所周知， HER家族的生长因子（ 配体 ）有 11种， 大致 可以 分为与 EGFR特异性 结合的 一 组（ EGF， TGF， 双调蛋白 （ AR）， 与 EGFR 和 HER4结合的 一 组（ 细胞素 （ BTC）， 肝素结合 EGF（ HB-EGF）， 表皮调节素 ）， 与 HER3、 HER4结合 的 一 组（ 神经调节蛋白 （ NRG（别名 heregulin）三类。 虽然 没有 与 HER2相对应的 配体 ， 但 HER2通常 会选择 能使之激活的 类似 配体 结合， 因此它 极易 与 HER家族其它成员形成 二聚体。
8、图 1.EGFR通路 。 EGFR是 一种 跨越细胞膜的受体蛋白。 酪氨酸激酶由 N lobe和 C lobe构成， ATP与 两个 lobe之间的 cleft结合。 EGFR-TKI在这 个部位 与 ATP竞争抑制。如果生长因子（ 配体 ）与受体结合，就 会 形成如图所示的非对称二聚 体（ dimer）， ATP 的磷被转移至 调控区 的 酪氨酸残基 上 。 各种蛋白与该磷酸化酪氨酸结合，下游 蛋白 不断地被 激活 ，尤为重要的是 图 中 所示的 RAS-RAF-MAPK通路 和 PI3K-AKT通路 。 胞外区 1-620 跨膜区 620-685 调控区 953-1248 酪氨酸激酶 68
9、5-953 细胞增殖 细胞生存 配体 通路 通路 iv 另一方面， 虽然 HER3因 氨基酸 替 换 而 丧失 酪氨酸激酶活性， 但 是 ， 作为 活化 磷脂酰肌醇 3激酶（ Phosphatidylinositol3-kinase/PI3K） 的 二聚体 ， HER3仍 保有 PI3K的 调节 亚基 p85的 多个 结合 位点 ，因此 对与 细胞凋亡 有 关的信 号 传导特别重要 3,4） 。 配体 在 胞外区 结合 后 ， EGFR分子 间 形成同二聚体 ， 也可 与 其他 HER家族分子 结合形成 异二聚体。 EGFR和 HER4结合形成同 二聚体的 活性 较 低 ， 形成异 二聚 体的
10、活性 则 升高， 尤其与 HER2结合的活性 。之后 胞内 区 的 酪氨酸激酶（ TK）被激活， 酪氨酸残基相互磷酸化 。 于是各种 接头蛋白（ PLC、 aCBL、 GRB2、 SHC、 p85） 与 该 磷酸化部位特异性结合 ， 并 被传递到下游的 RAS-MAPK通路 、 PI3K-AKT通路 、 STAT通路 等 。 从而导致了 增殖、细胞凋亡 逃逸 、血管新生、转移等 与 癌细胞 相关的 重要 特征 3,4） 。 在包括肺癌在内 的 各 类 肿瘤 中 ， 频繁发现 EGFR基因 的过度表达 ， 而且 还与预后有关 ，因此 EGFR作为分子 靶标 倍受瞩目。 小分子 EGFR 酪氨酸激
11、酶抑制剂 最初的 EGFR-TKI 吉非替尼（易瑞沙 ）在日本于 2002 年夏被 批准 。当初，在以女性、非吸烟者、腺癌为主的病例中 发现了 令人 惊讶 的 肿瘤缩小效果。 吉非替尼是 EGFR 特异 的 可逆 性 酪氨酸 激酶 抑制剂， 通过 在 EGFR 酪氨酸激酶上与 ATP 竞争结合 ， 发挥 其 抑制作用。 2007 年末被 批准 的埃罗替尼（特罗凯 ）也是 EGFR 特异 的 可逆 性酪氨酸激酶 抑制剂。吉非替尼的 最大耐受量 （ MTD） 是 700mg/天， 而 在 随机化 二期临床试验 中比较250mg 和 500mg 时， 发现 500mg 剂量组 的 不良事件率明显偏高
12、，但因为 二者的 抗肿瘤效果相同 ，所以 以后 推荐使用 250mg 剂量 5,6） 。 另一方面， 报告显示， 埃罗替尼的 MTD 为 150mg， 并 被作为推荐 剂量 使用 ， 在 使用 这些 剂量时，吉非替尼的谷值 浓度 为 0.4 M，与此相对埃罗替尼的谷值 浓度为 3.5 M7） 。 关于皮疹和腹泻等不良事件，埃罗替尼的发生频率较高。 另一方面，吉非替尼被 批准 之后， 产生的明显 副作用 是 致死的 急性肺 损伤 ，这 成为 了 最大的 问题。 其发病频率为 4 6%，发病者的死亡率 约 为 30%8） 。 令人不可思议的是 ， 这种 肺损伤 不仅 欧美存在 ， 亚洲的其他国家
13、也 存在 ，日本的问题 最 为 严重 。 在台湾实施的小规模研究中，发病率为5.8%9） 。 在 西日 本 胸部临床肿瘤研究机构（ WJTOG）实施的 1976 例 吉非替尼给药 患者回顾 性 研究中 ，不同临床背景 的 肺损伤 发病率 占全 部 病例的 3.5%，死亡 率为 1.6%。 不同临床背景的发病率 如下：男性 为 5.8%，女性 为 1.0%，非吸烟者 为 0.8%，吸烟者 为 6.2%，原有间质性肺炎为 13.9%，其它 为 3.8%8） 。 另一方面， 据 阿斯利康（ Astra Zeneca） 公司 实施的 巢式病例对照研究 （ nested case-control stu
14、dy） 显示， 吉非替尼 引起 的肺损伤比普通化疗制剂 的发生频率高，比值比 约 为 3 倍。 吸烟者、 原有 间质影的患 者 、 PS 不良、正常肺 占有率下降 、 55 岁以上、心血管系统并发症等 虽然 是危险因子，但 在 吉非替尼中 未能发现 特有的危险因子 10） 。 埃罗替尼的数据 目前 在收集当中， 但 特 定 使用 效果 调查（所有病例调查）的中间分析结果 显示 ，肺损伤的发生频率 为 6.2%， 1070 例中有 66例 ，基本与吉非替尼相同 。 EGFR 基因突变 众所周知， 从 二期临床试验阶段开始， EGFR-TKI 在女性、非吸烟者、腺癌、 东 方 人中表现出了优异的临
15、床效果， EGFR 基因突变在 这类 肺癌患者 中 的 发生频率较高 ， 在以 此前所报 告的 以 2880例病例为对象的 13 项 研究中， 发现 EGFR 基因突变的频率 与 东方人（ 32%）、 v 非东方人 （ 7%）、男性（ 10%）、女性（ 38%）、非吸烟者（ 47%）、吸烟者（ 7%）、腺癌（ 30%）、非腺癌（ 2%）等临床背景密切相关（图 2） 11） 。据爱知县癌症中心的研究显示， 在组织 类型、性别、吸烟等 临床 背景中与 EGFR基因突变独立相关的是组织 类 型和吸烟状况 12） 。女性肺癌几乎都是非吸烟者腺癌，因此，如果具备女性、非吸烟、腺癌三个条件，突变频率可达到
16、 63%左右。一方面，男性吸烟者腺癌中突变频率为 30%，女性吸烟者腺癌中为 50%，如果吸烟者发生腺癌就有相当大的机率存在 EGFR 基因突变。另一方面，男性吸烟者非腺癌中 EGFR 基因突变频率极低， 132 例患者中只有 2 例。 图 2. 不同临床背景下观察到的 EGFR 基因突变频率。 根据文献 中 2880 例 病例 进行的统计 11） 。 EGFR 基因突变率虽然在 腺癌中 较 高 ， 但 在 未分化腺癌 的大细胞癌 病例 和 腺鳞癌 13） 、小细胞癌14） （ 尤其 是 与腺癌的 复合 型 ）等 病例中也 经常检出 EGFR 基因 突变 *。 从腺癌的各亚型来看，具有细支气管
17、肺泡癌（ BAC）成分的腺癌 15） 在 发现 TTF-1 和表面活性物质的肺癌中发生频率较高 16） 。 虽然 EGFR 基 因突变集中在细胞内的酪氨酸激酶区 ， 但突变 频率 特别 高的 是 外显子 19 的 密码子 746-750 为 主要位点 的 缺失突变（ 48%）和外显子 21 的 密码子 858 由亮氨酸变为精氨酸（ L858R）的点突变 （ 43%），这两者占 90%以上 11） 。 但是， 在 这种 缺失突变 中 缺失氨基酸的个数和伴随氨基酸 替换 等 突变 类型 至少有 20 种， 而 据 Tanaka 等人 统计 ， 在 141 例 外显子 19 缺失突变的日本人 中，最
18、多的是 E746-A750 单纯缺失 ， 为 85 例， L747-E749 缺失 合并 A750P 突变增加的 为 12例 ， L747-S752 缺失 合并 P753S 突变增加 的 为 11 例， L747-S752 单纯缺失 为 5 例 等 17） 。 其次 多的是 密码子 719 的 点突 变（ G719X，氨基酸 为 C、 S、 A 时均相同，全部 表示为 X） 和 外显子 20 的 插入突变 ，分别在 3 4%左右。除此之外 ， 还发现了 少数 罕见的点突变， 也 存在一些出现多种突变的病例 （图 3） 。 EGFR 基因突变和 EGFR-TKI 敏感性 从总结的有关 EGFR
19、突变和 TKI 有效 的 1335 例报告来看， 在 EGFR 突变的 526 例 肺癌 患者 中TKI 有效 的有 377 例（ 72%） ，另一方面， 在 未突变 的 809 例 肺癌 患者 中 TKI 有效 的 只 有 80 例 *Toyooka等人的研究结果显示， 11例腺鳞癌中 EGFR基因突变率为 3例（ 27%） ， 其中 1例为 KRAS突变 。 另一方面，Tatematsu等人的小细胞癌研究结果显示， EGFR突变为 5/122， 但 如果限定与腺癌的 复合 型 ， 则 为 3/15（ 20%）。这些情况的EGFR突变同样存在于 鳞状细胞癌和小细胞癌的成分中，期待 EGFR-
20、KTI也 能 有效 。 报告显示 ， 在具有 BAC成分的腺癌中 EGFR突变率 为 50% 65%左右 。此外，具有 BAC成分的腺癌 相当于野口分类的肺泡置换型（ A、 B、 C型）， 且 EGFR突变率为 40% 60%。 vi 图 3. EGFR 基因突变的分布和不同基因突变的 有效 率 11） 。 （ 10%） 18） 。此外，很多 EGFR 突变的病例服用吉非替尼后 的 生存时间明显延长 19,20） 。最近 ， 在日本实施的针对 EGFR 基因突变阳性患者的 7 项前瞻性研究的 荟萃 分析 I-CAMP 中 ，全部 148 例病例中 有效 率为 76.4%21） 。 另一方面，没
21、有 EGFR 基因突变的病例的 EGFR-TKI 有效 率为 10%18） ， 我们认为 其中 EGFR 基因 检测 本身 存在 问题 ， 将未能检测出的突变也加了进去 ， 因此很难 解释。 在 去年发表的 IPASS 试验中（后述）， 突变阳性及阴性 病例 的 有效 率分别为 71.2%、 1.1%。 EGFR-KTI 的有效性 也因 突变种类 的不同而不同。外显子 19 缺失突变的 有效 率为 81%，与此相对 L858R 的 有效 率为 71%， G719X 的 有效 率为 56%。 值得 特别注意 的是 7 例外显子 20 的插入突 Yatabe 等人 将 具有 任意一个 BAC 成分
22、、 TTF1 或 表面活性物质 （ surfactant） 表达的肺腺癌称为 TRU（ terminal respiratory unit）型肺癌， 并 研究 了其 与 EGFR 突变的关系。根据 WHO 分类， 这相当于 众多非粘液型 BAC、众多乳头状 腺 癌、混合 型腺癌。 195 例腺癌的 76%（ 149 例）属于这种类型，其中 61%发生 EGFR 突变。 一方面， EGFR 突变的 97 例腺癌中有 94%是TRU 型。 另一方面， KRAS 突变的 26 例 腺癌 中 也有 15 例为 TRU 型 。即 TRU 肺癌包含 EGFR 突变肺癌这一关系。 氨基酸一词的缩略语。 A，
23、 丙氨酸； C，半胱氨酸； D，天冬氨酸； E，谷氨酸； F，苯丙氨酸； G，甘氨酸； H，组氨酸；I，异亮氨酸； K，赖氨酸； L，亮氨酸； M，蛋氨酸； N，天冬酰胺； P，脯氨酸； Q，谷氨酰胺； R，精氨酸； S，丝氨酸；T，苏氨酸； V，缬氨酸； W，色氨酸； X， 未知或其它氨基酸。 其它 EGFR 基因 有效 率（ %）（ N=327） 频率（ N=569） L858R 插入突变 缺失突变 G719X 激酶区 vii 变病例中没有 EGFR-KTI 有效 病例（图 3）。 作为临床上 的 最大问题，吉非替尼初期 有效 的全部 患者 ，在后期 均 产生 耐 药。 其中 50%患者是
24、在 缺失 或 L858R 等 的 敏感 性 突变 的基础上 ， 又 发生了第 790 位 密码子苏氨酸 向 蛋氨酸 的 突变（ T790M） 。 在 EGFR-TKI 治疗前很少存在 T790M（ 1 3%22） ） ， 这种情况下 TKI 难以 有效 。 此外，还报告了 肺癌多发家族中 存在的更为罕见的 胚细胞变异病例 23） 。 这证明 了 即使是单独的 T790M 也能使小鼠发生肺癌 24） ， 因此， T790M 突变 不仅 与吉非替尼 耐 药 相关 ， 还 可能与致癌相关 。 除此之外， 还报告了 L747S25） 、 D761Y26） 、 T854A27） 耐 药 突变 ， 但 不
25、能认为 发生频率 非常 低 临床意义就 大 。 另外 50%患者 中 ，其中 大 约 一半 患者的耐 药性 是 由 MET 基因扩增 引起的 ， 其机理是MET 基因扩增 没有通过 EGFR 激活 ERBB3 信号传导通路 ，从而 引起了 对 EGFR 激酶抑制剂 的 耐 药性 28,29） 。将来， EGFR-TKI 抗药性 出现时 再 进行基因 检测 ， 可以 选择 与其耐药机制相 对应 的治疗 方法 。即 在 一个患者的各种临床情况 中 ， 掌握 EGFR 与 相关 基因的 信息， 以期进一步改善临床疗效 。 EGFR-TKI 的临床试验和 EGFR 基因突变 在 EGFR-TKI 的
26、三期临床对照试验 中， 延续了 阴性 的 结果 。首先， 在观察 TKI 标准化学疗法的附加 效果 以 及 延 长 生 存 效果 的四个临床试验中， 所有 试验 结果均 表现 为 阴性 30-33） 。 在 TRIBUTE 试验的部分病例 中， 也 进行 了 EGFR 基因分析， 但 我们认为 EGFR 突变是 预后 良好因子， 而 不是埃罗替尼的效果预测因子 34） 。其次， 实施了 吉非替尼（ ISEL 试验 35） ）或埃罗替尼（ BR.21 试验） 36）和 最佳支持治疗 的对照试验 ， 但只有 BR.21 试验显示出了 TKI 的生命延续效果 。 报告显示， 在BR.21 辅助分析中
27、 ， EGFR 基因 拷贝 数 是 重要的效果预测因子，与突变无关 37） 。此外， 在 ISEL 试验中拷贝 数 成为 预测因子（无突变报告 38） ）。 最近的报告中， 在 与治疗 恶化或复发的非小细胞肺癌 二线以下的 多西他赛的比较试验中， 国内的 V15-32 试验 未 能证明吉非替尼的非劣 效 性 39） ，国外的 INTEREST 试验能够证明其 非劣效性40） 。在这些辅助分析 的 INTEREST 中 ，吉非替尼 EGFR 突变 阳性 的 无进展生存期（ PFS） 比 化学疗法长， 但 总生存时间（ OS）无差异 41） 。 V15-32 试验 中 ， 所有 EGFR 突变患者
28、的 预后 良好， 单 多西他 赛和吉非替尼 无差异 42） 。这些分析 只 是所有病例中 极少部分 的 回顾 性 分析 ， 而 并 不是 最终 的结果，因此很难解释。 效果预测因子和预后因子。 一般 讨论癌症的生物标志物时， 必须分析 其标志物是预后因子 （ prognostic factor） 还是 （效果） 预测因子 （ predictive marker）。 所谓预后因子 ，就 是不影响治疗且与生存期有关的因子，而效果预测因子 是 实施特殊治疗时与生存期有关的因子。 需要利用 某生物标志物 进行治疗选择时其标志物是预测因子。 在 EGFR-TKI 治疗的患者中，EGFR 基因突变 患者
29、的预后优于 未突变的 患 者 ，此时， 无法区别 EGFR 突变是预后因子还是预测因子。与实施化学疗法 的EGFR 突变 患者相比， 实施 EGFR-TKI 治疗的 患者 预后良好， 有了这些信息 才 可以说是 预测因子。 实际上 ， 根据 未使用EGFR-TKI 的肺癌切除后的预后分析， EGFR-TKI 突变阳性的 患者 至少在单因素分析中有预后良好的趋势。 但是， EGFR 突变 与女性、非吸烟者 这些 陈旧的预后良好因子有混淆 ， 只 分析基因突变的意义几乎是不可能的。 viii 表 1. 最近的吉非替尼临床试验与 EGFR 突变的关联 研究 设计 路线 有 EGFR 突变 无 EGF
30、R 突变 PFS OS PFS OS G CTx G CTx G CTx G CTx Takano44） 回顾性的 全部 - - 27.2 13.6 - - 13.2 10.4 观察性研究，无交叉 I-CAMP21） PII 1st 10.7 6.0 27.2 25.7 - - - - 非随机 化 ， 各种 化学疗法，交叉 CTxG100% ， GCTx ？ INTEREST41） PIII 2nd 7.0 4.1 14.2 16.6 1.7 2.6 6.4 6.0 Global,G vs.多西他赛，交叉 CTxG37% ， GCTx46% V15-3242） PIII 2nd 8 9 - -
31、 3 3 - - 日本， G vs. 多西他赛，交叉 CTxG53% ， GCTx60% IPASS45） PIII 1st 9.5 6.5 20 20 1.5 5.5 13 13 亚洲人， G vs 卡铂 +紫杉醇，交叉化疗 G39% ， G 化疗 49% ASCO2008 中 发 表 了 化 疗 后 依次 使 用 不 同 剂 量 吉 非 替 尼 的 III 期 临 床 试 验 结 果（ WJTOG0203） 。 吉非替尼 并没有 对 所有病例 都显示出 显著的 生 存 延 长 效果 ， 但 对 腺癌病例 表现 出了显著的 生 存延长 ， 另一方面， 非吸烟 病例 中 的所有 病例 生存状态
32、 良好 ， 但 两组间 无 显著 性 差异。吉非替尼组实际给予吉非替尼的病例只有 57%，化疗组 有 51%， 此外 非吸烟 化疗组中 作为后期治疗给予吉非替尼的病例为 76%， 因此变成了 难以解释的试验 43） 。 Takano 等人 将 国立 癌症中心内接受治疗的肺癌患者 分为 1999 2001 年和 2002 2004 年 两组 ，做 了 吉非替尼 上市 前 后 的 回顾性 分析 。 前者中仅有 15%接受了 吉非替尼的给药，相对 的 后者中有91%接受了给药。如果 在 EGFR 有无突变 的 条件下分析， EGFR 突变阳性的 2002 2004 年组 的MST 为 27.2 个月
33、，其它三组 的 MST 均 为一年 左右 44） 。 在 前 述 I-CAMP 中，作为一线 治疗 给予吉非替尼 的有 87 例 ， 二线以后 给予吉非替尼 的有 61 例。于是，在比较 一线 治疗 中 的 吉非替尼和化学疗法 之 后 ， PFS 的中 值为 10.7 个月 比 6.0 个月， 但 OS 无 显著性 差别（ 27.2 比 25.7 个月） 21） 。这些虽然不是 RCT，但是却明确指出了 EGFR 突变是 疗效 预测因子 。 EGFR-TKI 并不是对所有肺癌患者都 能 表现出 相同 疗效 的药物 ，因此 我们认为有必要 实施患者选择的临床试验。 在 2008 年的欧洲临床肿瘤
34、学会（ ESMO）上 ， 发表了 在亚洲实施的以 轻度吸烟或 非吸 烟 腺癌 患者 为对象 ， 卡铂 +紫杉醇对吉非替尼的 期临床试验 IPASS 的结果 45） 。 该试验中，在 亚洲人、吸烟史、腺癌这三个 临床背 景下选择患者。在该项研究中，证明了吉非替尼 PFS 的优越性。 亚组 分析 中 ， 在 非吸烟者未发生 EGFR 突变的情况下，吉非替尼组的 PFS 明显比化学疗法组短，作为 EGFR-TKI 的患者选择标志物 ， EGFR 突变 明显 比 吸烟史 更 重要（ EGFR 突变组、野生型组 的 HR 分别为 0.48、 2.85） 45） 。 2009 年 3 月至今 对 OS 一
35、直 处在 观察当中 ， 还没有得到最终结论， 但是 现在无 显著 性 差异 。 上述结果 总结 如表 1 所示。 这些数据 表明 ，不 应 把 EGFR-TKI 作为所有非小细胞肺癌的治疗药物， 而 是 应该作为治疗 有 EGFR 突变的肺癌的有效药物。 西日本胸部肿瘤临床研究机构（ WJOG）及北 东 日本吉非替尼研究小组（ NEJ Gefitinib Study Group） ， 将 EGFR 基因突变的肺癌病例随机分为吉非替尼 组和标准化学疗法组 ，并进行 了临床试验， 正在等待试验结果。 EGFR 基因检测的种类及其特点 直接测序（ Direct Sequencing）法 进行 DNA
36、 合成反应时， 正常 掺入 DNA 链的 合成 原料 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP（总称dNTP） 会使 DNA 链 延， 如果掺入 dideoxyNTP（ ddNTP）， 则会使 DNA 链 延伸终止 ， 利用该原理可 确定碱基序列（ Sanger 法）。现 如 今，荧光标记 的使用 已 被 自动化 。通常在几个小时内可确定300 个左右的碱基序列。虽然突变等位基因需要超过 20%且灵敏度不太好，但这是突变检测的 基本方法。委托 SRL 公司利用本方法进行突变检测。 ix 然而，现今在临床样本的检查中已很少使用本方法。为了增加灵敏度、减少成本、缩短分析时间、增加处理样本数等，
37、开发了许多以 PCR 为基础的方法。下面简单分析一下这些方法。 可以筛选突变的方法（可以检测出未知的突变） PCR-SSCP 法 该方法是利用 不同 单链 DNA 片段碱基序列特异性 的 高级 构象不同而导致 的 电泳 速度 差 异来 检测有无突变的方法。 片段 （ 长度 ）分析 利用 PCR 扩增 目的片段 ， 并 利用 基因分析仪 检测 PCR 产物的长度。由于在外显子 19 缺失和外显子 20 插入时会引起 DNA 长 度变化，因此 ， 如果是类似这样的突变， 即便是未知 突变 也 可以 进行筛选。 其他方法有 dHPLC（变性高效液相色谱法） 、 DGGE（ 变性梯度凝胶电泳法 ）等。
38、 高灵敏度、快速进行特定突变检测的方法 EGFR 基因突变 90%是 L858R 或外显子 19 的缺失突变，因此可以集中检测特定突变。几个试验可以同时检测多个突变。主要方法 的分析说明如下 。 PCR-RFLP（ 限制性片段长度多态性 ）法 当含有突变的碱基产生特定的限制性内切酶识别位点时，利用电泳确认其是否被限制性内切酶切断，从而检测突变。限制性内切酶识别位点也可以利用 PCR 引物 人工建立。 假设只有极微量的突变等位基因时， 利用电泳确认 限制性内切酶 是否能切断突变等位基因来检测突变 ， 进行 PCR-RFLP，之后设法将第二次的 PCR 产物突变特异性切断，这可以提高突变检测的灵敏
39、度。将这种方法称为 突变体富集 PCR 法，并委托 AVSS 公司实施。 等位基因特异性 PCR 法（ ARMS 扩增 阻滞 突变系统 ） 该方法是利用突变的碱基设计在引物 3端的引物，通过进行特异性扩增突变 DNA，检测有无突变的一种方法。通常的办法是错配多个 碱基 来增加特异性。 PNA LNA PCR-Clamp 法 该方法是一种将利用 PNA（ 肽核酸 ）阻 碍 正常序列的钳引物（ clamp primer）、 LNA（ 锁 核酸 ）作为检测探针使用的实时 PCR。 如果 PNA 和 LNA 错配 1 个碱基， 就会 大大 降低 Tm 值，因此与普通的 DNA 探针相比，特异性也有所提
40、高，可以进行高灵敏度测定。委托三菱化学 美迪恩斯株式会社利用本方法进行突变检测。灵敏度 1%左右。 PCR-Invader 法 在 PCR 之后实施 Invader 法。如果酶将 2 种探针和样本 DNA（ PCR 扩增产物）形成 3 条链的部位切断，则会产生荧光信号 ， 特别是 单碱基 突变 。 与仅依靠探针结合的实时 PCR 相比，特异性非常高。 可以进行 高灵敏度测定。委托 BML 公司 利用本方法进行突变检测。灵敏度 1%左右。 Scorpion ARMS 法 该方法是利用 与 荧光探针 相连 的 蝎状 引物（ Scorpion）进行的实时 PCR。通过将与探针部的突变部位结合的邻近碱
41、基（第 2 个碱基）与错配的碱基 替换 ，并与阻断延 伸 反应的 “ ARMS” 技术结合，提高特异性，从而可以进行 高灵敏度测定。国内的罗氏诊断有限公司销售全套试验器材，目前，正准备委托检测中心利用该方法进行突变检测。 灵敏度 1%左右。 Cycleave 法 该方法是检测点突变的一种方法。设计突变特异性探针，并将两 端用荧光色素和淬灭物质标记x 好。突变特异性碱基以 RNA 为模板合成，如果该碱基与 PCR 产物杂交，则由于所加入的 RNaseH是在 DNA-RNA 杂交的 RNA 部分切断探针的一种酶，因此探针的 RNA 部分被切断，淬灭物质脱离荧光色素，故荧光色素发出荧光。 iPLEX
42、 利用 质谱分析 可同时检测 24 个左右的突变。 灵敏度 5%左右。 SMAP 法 使用 从 高热分支杆菌 中分离得到 的新 DNA 聚合酶快速扩增核酸，该方法是利用快速核酸扩增系统的突变检测系统。灵敏度 1%左右。 其它突变检测方法有 高分辨熔解曲线分析 （ HRMA）等，表 2 中列举了文献 中主要方法的灵敏度和特性 46） 。 EGFR 基因检测 中 使用的临床样本及其处理 来自 不同 组织样本或细胞学样本均有可能发生基因突变。 在选择样本和检测方法时，详细了解其特点非常重要。上述的检测方法不同灵敏度不同，与此相同，作为检测对象的样本不同，其肿瘤细胞的确认方法和 含量 也不同，因此需要
43、特别注意。此外，由于检测公司不能确认肿瘤细胞是否存在， 因此其确认的责任 应 由送检 医师 承担 。 如果要 确认肿瘤细胞 存在与否 ， 与病理诊断医生密切合作是非常必要的。 1 肿瘤部位新鲜冷冻材料：可提取出最高品质的 DNA、 RNA。 在手术 现场 切割 取 样 的情况 表 2 主要 EGFR 突变检测的灵敏度和特性 46） 方法 灵敏度 （ %突变 DNA） 发现的突变 缺失、插入的 综合 分析 直接确定碱基序列 25 已知、未知 可 PCR-SSCP 10 已知、未知 可 Taqman PCR 10 仅已知 不可 Loop hybrid motility shift assay 7.
44、5 仅已知 可 Cycleave PCR 5 仅已知 PCR-RFLP 5 仅已知 不可 长度（片段）分析 5 可 MALDI-TOF based 5 仅已知 不可 PNA-LNA PCR clamp 1 仅已知 不可 Scorpion ARMS 1 仅已知 不可 dHPLC 1 已知、未知 可 单分子测序 0.2 已知、未知 可 突变富集 PCR 0.2 仅已知 不可 SMAP 0.1 仅已知 不可 也 比较多，但需要在显微镜下确认肿瘤细胞 含 量 。周围炎症严重的肿瘤、黏液产生过高的肿瘤、病变中心广泛纤维化的肿瘤的肿瘤细胞不 能 采集，以免产生假阴性结果。 切割 后 取其中 一半 ， 并利
45、用另一半切 面 制作组织标本， 然后 进行确认。 2 活检组织的石蜡切片：制作 5 片切片，其中 1 片进行 HE 染色，并确认肿瘤细胞的存在。特别是 TBLB 标本，病理诊断后再切薄，由于在制作好的标本中基本上没有组织，肿瘤细胞也已消失，因此需要注意。如果预计提前进行 EGFR 突变检测，在制作标本时多制作一些未染色标本 （白片） 也很有用。此外，即使病理诊断报告书上写明有肿瘤细胞，其 含 量 也 各不相同 ，最好靠病理医xi 生在诊断书上记录有多少肿瘤细胞。 检测公司有时也会要求厚切片（ 10 um），但多数情况下也可以是 5 um 左右（虽然大多检测实验室应该可以用几片未染色标本进行研究
46、，但是销售代表不知道，且不能检测 的样本也不能收取费用，因此 常常会多要求。最好是直接咨询 检测 人员 ） 。 在利用 PCR 的高灵敏度检测系统中，如果 DNA 中含有 1%左右来自肿瘤细胞的 DNA，则可以检测出突变，大部分活检病理标本是没有问题的。直接测序法需要 肿瘤 细胞的含量 在 20%左右。 3 手术样本的石蜡切片：制作 5 片连续切片， 其中 1 片进行 HE 染色，并确认肿瘤细胞的存在。 DNA 容易受固定的影响，长时间（ 1 周以上）浸泡在福尔马林中的样本的 DNA 会被片段化，不能检出突变。手术样本因各试验机构的不同，其固定方法、时间等 也不同 ，对此，活检材料的固定时间一
47、般是 1 昼夜，虽然肿瘤细胞的量很少 ，但大多可以保证 DNA 品质。在高灵敏度检测方法中，我们也考虑使用活检标本（图 4A）。 4 支气管洗涤液、胸水、 心 包 液 ：必须确认肿瘤细胞。在基因检测用时，将提交给细胞学等临床检查之后的剩余液体冷藏 /冷冻保存，或在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋 白质变性剂的 缓冲液（ AL 缓冲液 （ Qiagen 公司）等，混合，室温保存。由于细胞学样本的癌细胞含有量较低，因此必须使用高灵敏度检测方法。 图 4. EGFR 基因检测使用的临床样本及其操作。 A.被切成 10 微米的石蜡包埋标本。 B.在支气管镜下将刷检样本放在生理盐水中洗净 （悬浮），可
48、以就这样冷冻保存， C.进一步将该生理盐水液离心，沉淀溶解于 AL 缓冲液，此状态可以室温保存。 5 经支气管刷检细胞、经支气管穿刺 针吸 细胞和淋巴结穿刺 针吸 细胞，痰：将擦刷、穿刺针和痰用生理盐水或 PBS 充分悬浮之后分成一半，一方面提交给细胞学检查，在基因检测用时，将剩余液体冷藏 /冷冻保存，或离心后在含有细胞成分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液（ AL 缓冲液 （ Qiagen 公司）等），混合，室温保存。因为痰样本本身可能已经变性，所以加入含有蛋白质变性剂的缓冲液（ AL 缓冲液 （ Qiagen 公司）等）， 混合，室温保存。由于样本间的肿瘤细胞量差异显著，因此在进行消
49、除上述样本差别操作的同时，需要使用高灵敏度检测方法 （图 4B、4C）。 6 血液：血液是容易采集的样本，如果稳定且可检出突变的话，则是理想的样本，但是目前还处于研究阶段。有报告显示，利用从血浆或血清中提取的可溶性 DNA 也可以检出突变 47） ，但是有关取自肿瘤的 DNA 的报告很少，且需要使用 Scorpion-Arms 法等灵敏度非常高的检测方法。2008 年发表了利用上皮特异性抗体 包被 的微柱捕捉 循环 血中的癌细胞（ circulating tumor cell:CTC），并进行 EGFR 基因分析的报告 48） 。报告显示，使用该方法的重现性较好，可以进行EGFR 基因分析。而且该方法的灵敏度比血浆好，但是目前还不能应用于临床。 xii 委托几个检测公司进行 EGFR 突变检测。各公司的检测方法不同，直接测序法（ SRL）、 PCR invader（ BML）、 PNA-LNA PCR clamp（三菱美迪恩斯）、 突变富集 PCR（ AVSS）， Scorpion ARMS（国内出售整套试验器材的是罗氏诊断公司，目前， 正准备委 托检测中
