1、2019/3/2,仪器分析,使用教材：朱明华编 主讲教师：韩 权,第三章 高效液相色谱 分析,2019/3/2,第一节 高效液相色谱法的特点,一、概述 二、特点1高压：一般可达15035010 Pa。 2. 高速：一般可达110 ml/min。3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：如荧光检测器灵敏度可达10 g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：,-11,5,2019/3/2,第二节、影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 一、液相色谱速率理论影响色谱峰扩展因素,2019/3/2,二、. 影响分离的因素流速,由图3-1知，液相色谱H-u曲线与其相色谱不
2、同，当流速大于0.5 cm/s时，是一段斜率不大的直线，只是因为分子扩散相对H值的影响可以忽略不计。在液相色谱中，使用较高流速，柱效下降不明显，有利于实现快速分离。,提高柱效的途径：减 小填料粒度以加快传质速率；提高柱内填料装填的均匀性。,2019/3/2,第三节、高效液相色谱法的主要分离类型,a. 正相液液分配色谱法: 流动相的极性小于固定液的极性。b. 反相液液分配色谱法: 流动相的极性大于固定液的极性。c. 液液分配色谱法的缺点：固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相，可克服上述缺点。,1 液 液分配色谱法及化
3、学键合相色谱流动相和固定相都是液体。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达平衡时，服从于下式：,2019/3/2,2. 吸附色谱（液-固吸附色谱）,流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下： Xm + nSa = Xa + nSm式中：Xm-流动相中的溶质分子；Sa-固定相中的溶剂分子；Xa-固定相中的溶质分子；Sm-流动相中的溶剂分子。当吸附竞争反应达平衡时： K=XaSm/XmSa式
4、中：K为吸附平衡常数。讨论：K与保留值的关系,2019/3/2,3. 离子交换色谱,IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下： X -(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)= (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中) 当交换达平衡时： KX=-R4N+ X- Cl-/-R4N+Cl- X- 分配系数为： DX=-R4N+ X-/X-= KX -R4N+Cl-/Cl- 讨论：DX与保留值的关系,2019/3/2,4 离子对
5、色谱法(Ion Pair Chromatography),离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示： X+水相 + Y-水相 = X+Y-有机相式中：X+水相-流动相中待分离的有机离子）；Y-水相-流动相中带相反电荷的对离子（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y-形成的粒子对化合物。当达平衡时： KXY = X+Y-有机相/ X+水相Y-水相根据定义，分配系数为： DX= X+Y-有机相/ X+水相 = KXY Y-水相
6、离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。,2019/3/2,5 离子色谱法(Ion Chromatography),原理： 用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。 以阴离子交换树脂(R-OH)作固定相，分离阴离子(如Br-)为例。当待测阴离子Br-随流动相(NaOH)进入色谱柱时，发生如下交换反应(洗脱反应为交换反应的，的逆过程)：,以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同
7、。,2019/3/2,离子色谱具有以下优点：,（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；,（2）分离能力高在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。,（3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）仪器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蚀,2019/3/2,离子色谱的应用,阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm), 流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/h。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。,2019/3/2,6
8、. 空间排阻色谱(Steric Exclusion Chromatography),以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径（x nmx00 nm）的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶。机理：当试样进入凝胶色谱柱时，尺寸过大的分子完全不能渗透到胶孔中去而受到排阻，沿胶粒之间的间隙直接流出色谱柱，产生一个色谱峰；尺寸过小的分子可完全渗透到胶孔中去，流动速度慢，最后流出色谱柱，产生一个色谱峰；中等尺寸的分子 ，以其大小的不同，可渗透到某些孔穴而不能进入另一些空穴，流出速度取决于分子尺寸的大小, 按分子尺寸由大到小的顺序先后流出色谱
9、柱，从而实现分离。应用：适合分离分子量大的化合物（100800,000)，只要相对分子量相差大于10%。,2019/3/2,第四节 液相色谱法固定相,一、液液色谱法及离子对色谱法固定相 1担体 (1) 全多孔型担体： a. HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的100m全多孔型担体。缺点：填料的不规则性和较宽的粒度范围会导致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在“裂隙”在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。,b. 现在采用10 m全多孔 型担体，它是由nm级的硅胶微粒堆积而成为5 m或
10、稍大的全多孔小球。优点：颗粒小而均匀，传质快（距离短），柱效高。,2019/3/2,担体,(2) 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）：它是直径为 30 40 m 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ，表层上附有一层厚度约为 1 2m 多孔表面 ( 多孔硅胶 ) 。,2固定液液液色谱流动相和固定相都是液体，因此要求两相要互不相容。在液-液色谱中常用的固定相也只有极性不同的几种，如，-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鲨烷等。,优点：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快,易于填充均匀,柱效高。 缺点：柱子容量低、需要配用高灵敏检测器。这种担体目前应用较为普遍。,2019/3/2,液液色谱法及离子对色谱法
11、固定相,3化学键合固定相：即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。根据在硅胶表面 (具有SiOH基团) 的化学反应不同，键合固定相可分为： 硅氧碳键型( SiOC ): 硅氧硅碳键型(SiOSiC):稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广。 硅碳键型(SiC): 和硅氮键型（SiN):,2019/3/2,液液色谱法及离子对色谱法固定相,化学键合固定相具有如下一些特点： . 表面没有坑，比一般液体固定相传质快得多； . 无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命； . 可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析； . 有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测
12、器和馏分的收集。,2019/3/2,2019/3/2,液相色谱法固定相,二、液固吸附色谱法固定相 采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。 三、离子交换色谱法固定相 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体，在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。 2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。,2019/3/2,液相色谱法固定相,四、排阻色谱法固定相 1. 软质凝胶：如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相，在常压下使用。 2. 半硬质凝胶：如苯乙烯二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶），是应用最多
13、的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。 3. 硬质凝胶：如多孔硅胶、多孔玻璃珠等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶。 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。,2019/3/2,第五节 液相色谱法流动相,选择流动相时应注意下列几个因素： (1) 流动相纯度：防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 (2) 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子：如在液-液色谱中，流动相应与固定液互不相容，否则，会使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 (3) 对试样要有适宜的溶解度：试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。 (4) 溶剂的
14、粘度小些为好：否则，会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。 (5) 应与检测器相匹配：例如，当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,2019/3/2,液相色谱法流动相,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。例如，采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小)有时还需要选用二元或多
15、元溶剂，以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。选择时要参阅有关手册，并通过实验确定。,2019/3/2,第六节、高效液相色谱仪,液相色谱仪(1),2019/3/2,液相色谱仪（2）,2019/3/2,液相色谱仪（3）,2019/3/2,液相色谱仪（4）,2019/3/2,高 效 液 相 色 谱 仪 流 程 图,2019/3/2,高效液相色谱仪,1.高压输液泵HPLC使用的高压泵应满足下列条件： a. 流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为110 mL/min）； b. 能抗溶剂腐蚀； c. 有较高的输液压力；对一般分离，60105Pa的压力就满足了，对高效分离，要
16、求达到150300105Pa。,(1) 往复式柱塞泵,2019/3/2,高效液相色谱仪,(2) 气动放大泵,2019/3/2,高效液相色谱仪,2. 梯度淋洗装置梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。梯度洗提可以分为两种：,a. 低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。,2019/3/2,梯度淋洗装置,b.高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按按设定的比例
17、送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。,2019/3/2,高效液相色谱仪,3. 进样装置 (1).注射器进样装置：进样所用微量注射器及进样方式与 GC法一样。进样压力150105Pa时，必须采用停流进样。,(2).高压定量进样阀： 与GC法用的流通法相似，能在高压下进样。其结构如图所示：,2019/3/2,高效液相色谱仪,4. 高效分离柱常用的标准柱型是内径为 4.6 或 3.9mm ，长度为 15 30cm 的直形不锈钢柱。填料颗粒度 5 10m ，柱效以理论塔板数计大约 7000 10000 。在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 发展趋势是减小填料粒
18、度及柱径和柱长，以提高分析速度和柱效；研制高效柱填料是一活跃领域。,2019/3/2,高效液相色谱仪,5. 高效液相色谱检测器 (1).紫外光度检测器,特点： a.灵敏度高； b. 线性范围宽； c. 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； d. 对流动相的流速和温度变化不敏感,可用于梯度洗脱；,e. 波长可选,易于操作。缺点:对紫外光完全不吸收的试样不能检测；同时溶剂的选择受到限制。,2019/3/2,高效液相色谱检测器,(2). 光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；阵列由1024个光电二极管阵列，各检测一窄段波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,2019/3/
19、2,2019/3/2,光电二极管阵列检测器,2019/3/2,高效液相色谱检测器,(3).荧光检测器 高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,2019/3/2,高效液相色谱检测器,(4). 示差折光检测器除紫外检测器之外应用最多的检测器；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比。,通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；,2019/3/2,高效液相色谱检测器,(5).电导检测器 其作用原理是根据物质在某些介质中电离后所产生电导变
20、化来测定电离物质含量。,2019/3/2,第七节 高效液相色谱分离类型的选择,要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。 1、相对分子质量对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在200 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。,2019/3/2,2.
21、溶解度水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。 3. 化学结构若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。,高效液相色谱分离类型的选择,2019/3/2,高效液相色谱分离类型的选择,2019/3/2,第八节 高效液相色谱
22、仪应用实例,固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷流 速：1.5 mL/min色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,1. 环境中有机氯农药残留量分析,2019/3/2,2. 稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。,固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水 100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min流 速：1mL/min柱 温：50 C柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器,高效液相色谱仪应用实例,2019/3/2,高效液相色谱仪应用实例,3.阴离子分析双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相：0.
23、003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/h。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。,2019/3/2,第九节 液相制备色谱,分析型色谱:分离; 柱径1 6cm，长度为 15 30cm） 制备型色谱:获得试样中需要组分的较大量纯品。制备柱：内径由约10mm的实验室半制备柱到直径为500mm的工业制备柱。如，内径，8mm,长度15 30cm的半制备柱，一次制备量.1mg。,1.色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；分析型分离柱：进样量1mg/g吸
24、附剂，严格说柱容量的1%，保留值（k）和柱效（H）不随进样量变化。制备型色谱柱：进样量柱容量，即超载。此时，随进样量增大，柱效迅速下降，峰变宽，R减小。制备型色谱柱允许超载，超载可提高制备效率，但以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,2019/3/2,液相制备色谱,2. 液相制备色谱的方法液相制备色谱可能出现图3-26所示的几种典型情况。 a. 欲分离组分呈一个峰； b. 两个或多个主组分； c. 较少的组分是欲分离制备的化合物；对于第一种情况（图3-26a），可按图3-27所示的方法处理。.首先在分析型HPLC上进行试验（图3-27a），选择出最佳的分离条件，亦即获得最大的R值（图3-
25、27b）；. 增加进样量，直至峰刚好开始重叠（图3-27c），此进样量即为柱子的最大负荷；.如果需要的纯品得的量不是很大，可以将柱径及最大进样量（最大负荷）按比例扩大，同时，扩大输液泵流量，即成为制备色谱。其分离方式同图3-27c；如果需要更大量的纯品，可使柱子超载运行，此时峰出现部分重叠，用中心切割法收集部分馏分，用薄层色谱检验纯度，多次制备合并馏分。,2019/3/2,液相制备色谱的方法,对于第三种情况（图3-26c），较少的组分是欲分离制备的化合物，即欲分离的物质是试样中的微量或痕量组分，使用的制备方法如图3-28所示。. 可用前述方法达到最佳分离度后，利用超载进行富集（图3-28b）, 多次制备富集合并馏分；. 富集后的馏分，欲分离的组分成了主组分，可再次按第一种情况（图3-26a）处理（分离制备）。,2019/3/2,液相制备色谱,3. 制备型液相色谱典型的制备型液相色谱仪的结构及流路如图3-30所示。结构与分析型一样，但泵流量大（20100mL/min）、进样量大、采用制备柱（内径2050mm，柱长50cm）；在检测器后增加自动馏分收集器。,
