1、首都师范大学硕士学位论文羊肚菌菌丝体培养及菌丝分化研究姓名：付晓燕申请学位级别：硕士专业：植物学指导教师：范黎20060520摘 要羊肚菌是珍贵的食、药用真菌。本文对分离自羊肚菌子实体的组织分离菌株及单孢分离菌株，经形态学和分子生物学鉴定，从中筛选6个菌株作为供试菌株，经菌株间杂交及其继代培养发现，实验所用的两种羊肚菌之间不发生融合现象，分别为黑脉羊肚菌rchena 8ngUStic印s热糨簿辙警蒿硅crassipes；年磺究1本霉强njchoderma sp及黑腐皮壳属肠船sp真菌对羊胜菌生理生长的影响，发现木霉属及黑腐皮壳属的提取液对羊肚菌菌丝体生长有促进作用；探讨了羊肚菌的菌根营养，结果
2、表明黑脉羊肚菌可与群众杨(角凇船p掣z?ar汹组织培养苗形成前菌根，即缺乏菌套和哈蒂氏网，并目羊肚菌i杨树组离彤姨漭嘟协期嚆核明显增大初步建立了羊肚菌的原生质体制备与再生技术。确定了粗柄羊肚菌膨弧或船原生质体制备晦最隆和限即：采用培养3天自g菌丝，以o-6II。l几1作为稳渗荆配制的4圈缸蜗牛酶，墨曲d溶壁酶的混合酶液为细胸壁降解酶液，30，50邓影缸n酶解3h。rels are r疆e wilding fun舀js and f姗ls for the outstanding value both in ph鼬碥c0109yfIledical uses and ediblenes SIn thi
3、s paper，strains were obtainedby tissue isolation and singlespore is01ation By morph0109y and r【101ecular biology，six strains were selected to studyweobserved the cultural characteristics of hybridization aild secondary culture of rnarel研celiaof膨a，础尹stjcI印s and膨cf五5：卯Jol9 The result showed that the h
4、yphae from the abovetwo species of埘rD础已Ja can not occur hyphal fusionsWe researched the influences0n the哪celial口舭h of麒玑知，肠spproduced by行动。幽册spand如船spwhichfrom tissue isolation of崩叠诅纠肠spand fbL】nd that the extractions fr叼啦力1jc厅0出抑78 s口and 昭船sp can accelerate mycelial growth of物阳方e厶sp ne aSsociationbe
5、t霄een lIDIlel and plant Was discussed：the results indicated彪 a，毋疆芒jc印s can formpH町con电izas with the tissue culture seedlings of R删正似珥科如r括，but this唧c叽hizic types lacked of H锄tle andbrtig net：and sclerotia by cncu!tivation of彪锄秘拓Fand只础抽打senl口ged distinctlyThe technique of preparation 8nd regenerationo
6、f prot印1aSts fr一施r动以如SpwaS built肌d the optiflnl conditions for preparation ofprotoplaSts foIIl膨黜西船wele exafIlined：the largest n岫ers of protoplaSts were obtainedWith IIlixte smilase(41119m1)and lyWallzy糟(白gm)after hypha cultured fbr 3 days，30，50r向jn and 3 hours enzylysis in o例Nacl o辄Dtic stabilizersK
7、ey words：胁憎斤PJ a，7H幽D幽黝， 跆5a， 删心册础妇咄pr娜rcolThizaS，protoplaSt2首都师范大学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：俏J场兹 目期咖制。月湘首都师范大学位论文授权使用声明本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送
8、交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文怍者签名：竹嘞磋日期：必晦p谰前 言前 言羊肚菌(肋rc方“如Dillex Pers)，俗称羊肚蘑、羊肚菜、羊肚子、编笠菌、羊雀菌。因其菇盖表面凹凸不平，形态酷似羊肚(胃)而得名。真菌学分类隶属于子囊菌门(Ascomycota)，盘菌纲(Discomycetes)，盘菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌属(肋础e拈)，是一类大型的食用兼药用真菌
9、，最早收录于李时珍的本草纲目。羊肚菌营养丰富，风味独特，在美国被称为“陆地鱼”，欧美一些发达国家认为它是人体营养的高级补品。羊肚菌还具有较高的药效，其菌体内含有大量的多糖等成分，具有较强的抗肿瘤作用，调节免疫功能，抗疲劳，并能减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用n1。由此可见，羊肚菌是_种具有开发前景的珍稀食用菌，并可出口创汇，其在医药、食品、保健品、化妆品等领域具有较高的应用价值。现将羊肚菌资源情况及国内、外对羊肚菌的有关研究综述如下。1羊肚菌属的种类及分布羊肚菌属的分布是世界性的，在亚洲、欧洲及北美洲的一些国家均有分布。国外主要分布于法国、德国、美国、印度等地；国内分布较广，在辽宁、山东、云南
10、、甘肃、湖南、河南、内蒙、河北、山西、北京、西藏、安徽、台湾、宁夏等28个省市、自治区都有所分布。该菌常发生于各种杨树、栎树、柳树、苹果树、松树下，以及云冷杉林下和各种阔叶树的采伐迹地。羊肚菌多生长于石灰岩或自垩质土壤中，在腐殖质土、黑黄色壤土、沙泥混合土、砾壤土中均有出现，尤喜生于火烧迹地上，及旧苹果园。不同历史时期不同学者对羊肚菌属分类有着不同看法，有人认为该属有50多个种，但在1984年，Em订e Jacguetant认为许多种名是无效的，而将羊肚菌属划分为28个分类单元，Kirk PM等在真菌词典第9版中也将羊肚菌划分为28个种“1。国内戴芳澜(1979)中国真菌总汇记载有8种，即小顶
11、羊肚菌膨a增sjc印s Peck；尖顶羊肚菌彪c伽jPers：粗柄羊肚菌膨c，ass助Ps(Vent)Pers：小羊肚菌，托幽jc，osa Fr：开裂羊肚菌彪以sf舢占Fr：高羊肚菌彪P拈招Fr；羊肚菌膨Psc“舯抬(L)Pers：硬羊肚菌彪，j耵幽Krombh“1。据目前报道资料统计，我国现有羊肚菌15种。首都师范大学硕士学位论文 羊肚菌菌丝体培养及菌丝分化研究2羊肚菌的生物学特性21子实体的形态特征肉质，稍脆。菌盖呈不规则圆形或长圆形，有的近球形，呈凹穴，淡黄褐色，干后变为褐色或灰黑色，表面突起的棱纹纵横交叉，呈不规则或多角形的网格状，凹穴表面分布子实层。菌柄与菌盖边缘紧相连，近柱形，白色
12、，中空，有浅纵沟，基部稍膨大。子实层由子囊和侧丝组成，子囊呈长圆柱形，成熟子囊常(200320)岫(1822)帅，内有8个子囊孢子，无色，单行排列。子囊孢子椭圆形，常(2024)啪(1525)m，侧丝顶端膨大”1。应该指出的是不同种的羊肚茵在形态上有很大的区别，即使是同一种羊肚菌的不同个体在形态上也有差异11。据R嘶er描述，子实体的形成过程可分为三个阶段n”：(1)早期的原基由单一菌丝产生，大小1衄左右，为呈辐射状排列的菌丝团聚体，随后进一步发育，并在团聚体中央产生致密交织的核心，不定菌丝自原基基点的较低表面伸出；(2)很快(次日)子囊盘基即形成并突出于球形的原基表面，呈指状，基部肿大，伸长
13、至3哪时，基部出现沟纹，并越来越明显；(3)予囊盘基继续生长，4天内高达5岫，其中部至顶部出现微细的垂直卷曲，以致菌盖呈花纹状。22菌丝的形态特征一般情况下，生长初期，羊肚菌菌丝为白色或淡黄色，有光泽，尖端分泌有针尖大的无色露珠，随后菌丝尖端呈多指状或树枝状分枝，开始时分枝少，而后逐渐增多并交织成网格状，构成一个复合的整体。生长中期，羊胜菌菌丝一旦在培养基上形成菌落，便分泌出一种深褐色色素至培养基中，色素由菌落中心较老的菌丝分泌，使菌丝呈棕黄色。随着菌丝的老化，菌丝分泌的色素扩散到平皿四周，使菌落由深棕色转为污棕色，光泽随之消失”“”1”。值得注意的是：不同种的羊肚菌菌株具有不同的培养特征，包
14、括生长速度、生长习性、菌核发育、菌丝和菌核的颜色等都有明显的差异。即使是羊肚菌的同一菌株在不同的培养基中的培养特征也不完全一致。因此，全面地研究和描述羊肚菌菌丝的培养特征，可作为鉴定羊肚菌的初步依据和辅助手段。2。3菌核的形态特征羊肚菌的菌核可分为两个类型，即基内菌核和气生菌核。一般先形成基内菌核，再形成气生菌核。基内菌核是由基内菌丝逐渐形成毡状、点状或片状的菌核团或菌核堆。变，前 言化过程为：针尖大的幼菌核由淡黄色中心杏黄、四周淡黄色棕色卜深棕色-污棕色的老龄菌核团(堆)，具有很强的再生能力，最大可达32cmx 25cm。气生菌核是由气生菌丝尖端开始形成淡黄色点状菌核，并逐渐增多形成菌核堆，
15、最大可达2cm15cm。颜色变化为：淡黄色中心棕色、四周淡黄色或乳白色棕色污棕色，并由有光泽的幼龄阶段进入无光泽的老龄阶段，但仍具有很强的再生能力“。光学显微镜下观察成熟的菌核，其菌丝呈膨大的近等径细胞。将菌核压碎，内部有许多油滴状物，是一些作为进一步发育的贮备营养脂类n”。此时，菌核可耐低温和干燥等不利条件。实验表明，不同的羊肚菌种所形成的菌核在大小、形状、颜色、数量上也不尽相同，说明其存在遗传差异性n“。菌株不同，其菌核的形成特征也存在差异n”，有的菌株形成菌核早，菌丝老化的也比较早；有的菌株形成菌核晚，但菌丝不易老化。这说明菌核的产生直接关系到菌丝老化的早晚，且菌核多，聚集的养分就多，耐
16、f氐温和抗干燥的能力就强“。24繁殖和生活史虽然Ron嘶er(1986)首先指出羊肚菌子实体是从菌核分化生长出来的，但一个完整的羊肚菌生活史却是Tho腿s v01k(1990)首先提出的n”。营养菌丝在羊肚菌的营养生长以后的生活史中可能有两个发育途径(图1)：途径I：羊肚菌的子囊孢子在适宜条件下荫发，生成初生菌丝，这些菌丝间尚未发生质配。当外界条件不适宣菌丝进一步营养生长时。如养分涸竭，水分不足，温度不利等，则可直接形成菌核。某些养分如羊粪也能诱导茵核形成。这些初生菌核能越冬并在春天萌发而形成产子实体的菌丝，若无适宜的条件，即无合适的环境或营养征象，则初生菌核便萌发，形成新的初生菌丝，重新进行
17、营养生长。途径H：羊肚菌子囊孢子萌发生成的初生菌丝，与另一亲和性初生菌丝发生相互作用，相互融合而产生稳定的异核体菌丝，二个基因型不同的核能起遗传互补作用而亲和。如条件不利于进一步生长，则形成异核菌核。经受冬季冷冻及早春融化条件影响后，异核菌核有两个萌发方向：一是形成次生菌丝，继续进行营养生长：二是形成子实体，进而发生有性生殖。途径I与途径II的差异在于菌丝间是否发生质配并形成异核体。非异核体的菌核能否形成子实体尚有争议。在这个生活史图中还没有完全画完的是无性生活周期，因此，羊肚菌的无性生殖有待于迸一步研究。首都师范大学硕士学位论文 羊肚菌菌丝体培养及菌丝分化研究图11 羊肚菌生活史图(引自Th
18、omas，1990)25生理学、细胞学、生物化学与分子生物学研究国内许多真菌学家和爱好者在羊肚菌资源调查和生态环境考察、形态学研究等基础上，对其生理特性、人工培养的生态条件、生化分析等方面展开广泛深入的探索性研究，希望为实现羊肚菌的人工栽培提供理论依据和工艺路线。251生长发育的营养要求羊肚菌在多种真菌培养基上都能生长发育，其菌丝长速差异不明显，但菌丝的长势却存在着十分显著的差异。因此，研究碳、氮源以及其他物质对其生长发育的影响仍非常重要。2511碳、氮源Brock(1951)认为羊肚菌的较好碳源是可溶性淀粉、果糖、麦芽糖、葡萄糖、松二糖、较好的氮源是半胱氨酸一盐酸、天门冬氨酸、天冬酰胺、尿素
19、、亚硝酸钠、各种铵盐、丙氨酸、谷氨酸一盐酸、硝酸钠，而柠檬酸铵、硫脲、羟胺一盐酸、肼一盐酸对羊肚菌有毒害作用。林杰等(1993)1认为羊肚菌腻8sc“即ra和尖顶羊肚菌麒c。njca的最佳碳源是马4前 言铃薯和麦芽汁，其次是果糖、葡萄糖、蔗糖，最差的是可溶性淀粉。最佳氮源是蛋白胨，天门冬酰胺和天冬素次之，硝酸钠、酒石酸铵较差，草酸铵则完全抑制菌丝生长。董爱荣等(2002)”1认为羊肚菌彪曾sc以印招的最佳碳源是蔗糖，果糖、葡萄糖次之，麦芽糖、乳糖较差。较好的氮源是尿素、酒石酸铵，蛋白胨、天门冬素较差，甘氨酸最差。尤国信等(1995)“81认为麒e占c以印招的最好碳源是蔗糖，其次是葡萄糖和甘油。
20、最好的氮源是硝酸钾，其次是尿素、硝酸铵和硫酸铵，不能利用蛋白胨。杨绍彬等(1998)“”对培养基质研究后认为应注意培养基的cN比值应小于20：1(认为菌丝生长阶段需要较高的氮源)。刘士旺等(1998)“1认为尖顶羊肚菌麒c鲫j合适的cN是35：l。肖锋等“(2000)经实验表明，羊肚菌彪8以鲫妇最优的碳氮组合是蔗糖一尿素，最佳的碳氮比是18：1。董雪m1(2004)经实验表明，黑脉羊肚菌(膨a饱螂fjc印s)的较好碳源是可溶性淀粉和麦芽糖，其次是蔗糖和葡萄糖，不能很好利用甘油和甘露醇：较好的氮源是硝酸钾和硝酸钠，尿素、蛋白胨、硫酸铵和硝酸铵则较差。适宜羊肚菌菌丝生长的碳氮比为20：l30：l，
21、最佳碳氮比为25：l。看来在可溶性淀粉、蛋白胨、尿素等利用上以及CN的比值上存在相当的争议，这可能与各自采用的实验方法、材料来源有关。曲新民等恤(1990)提出不同种的羊肚菌，对不同碳、氮源的同化吸收各异，从而构成了其营养生理的多样性。王秀云汹1(1998)认为，即使同一株羊肚菌，在不同营养条件下菌丝形态、颜色等也不完全相同，这些差异反映了羊肚菌生理特性的多样性。所以，为了不同的培养目的，可以选择不同的培养基。2512维生素有人认为羊肚菌是一种生长素自养微生物，维生素B，和B。、泛酸、尼克酰胺、B一丙氨酸、次黄嘌呤对它的生长无作用。董爱荣等(200岔)m经试验表明，维生素B。对羊肚菌挺e口朝妇
22、的生长有轻微的抑制作用。Melin报道维生素B。对粗柄羊肚菌生长无促进作用。龙正海等”钉(1990)认为维生素Bl、维生素B2、维生素B6、维生素H、叶酸对尖顶羊肚菌Mconica的菌丝生长有微弱的促进作用，而维生素C、维生素B12用量过大时可能有抑制作用。可见，维生素对羊肚菌生长的影响还没有较一致的结论，还有待于进一步研究。251，3微量元素龙正海等“(1990)经试验表明，Mn、Zn、cLI、Se等微量元素对尖顶羊肚菌彪c，c拉菌丝生长影响最大，Mo、Ni、Pb、A1均有不同程度的促进生长，Cd、Ti、Ag对生长则完酋都师范大学硕士学位论文 羊肚曹蕾丝体培葬及菌丝分化研究全抑制。zn+Mn
23、+cu、Zn+Mn、zn+Mn+Mo、zn+Mo对生长存在元素协同效应。并且不同浓度微量元素对羊肚菌菌丝生长影响不同：Mn浓度为5魄珂l时对尖顶羊肚菌膨c叩j菌丝的生长促进作用最明显，在l50憎m1浓度范围内均有不同程度的促进生长。刁治民等“”(2001)关于微量元素Mn对羊肚菌膨Psc“册招生长影响的研究，亦得出同样的结论。2514有机酸和提取物质金若忠汹1(1997)报道，苹果酸和丙二酸钠的铵盐可刺激羊肚菌生长。琥珀酸、延胡索酸、乳酸、羟基乙酸对羊肚菌无多大影响。Hans Hurni提出苹果提取液有利于羊肚菌生长。Robbin等发现，木材提取液、番茄汁、麦芽提取液对羊肚菌生长有促进作用，其
24、中木材提取液作用最大，并认为可能是由于它们提供了某种活性物质。252生长发育的其它要求羊肚菌苗丝体生长、菌核的形成、子实体的生长发育除需丰富的营养基质外，还必须在特定的外界条件下，才能使营养生长转向生殖生长，形成子实体原基，进而发育成正常的子实体。这些条件包括温湿度、酸碱度、适宜的光照和充足的空气。曲新民等“21(1990)对四株羊肚菌菌株进行试验表明，在lO25之间各菌株生长速度随温度增高而加快，30以上生长减慢，35时菌丝几乎不扩展。朱斗锡“”(1992)研究认为，菌丝体在328下均能生长，最适生长温度范围为1822。子实体最适生长温度为1518。王秀云越1(1998)对四株羊肚菌菌株的生
25、物学特性研究指出，lO30均能形成正常菌落，但长速差异很大。在1025菌丝生长随温度升高而加速，在2530生长逐渐交慢，30以上迅速变慢，至35以上几乎停止生长。在20以下时，菌丝普遍洁白浓密，25以上，菌丝灰白稀疏，并随温度升高稀疏度增加。因此，羊肚菌的适宜生长温度为2025，以25最适。董爱荣等1(2002)亦认为羊肚菌菌丝在25生长最好，菌丝致密，日均生长量为136唧。有关菌丝生长的最适酸碱度，林杰等认为中性或微碱性皆适于羊肚菌的生长。王秀云认为pH值7最好n”。陈惠群认为尖顶羊肚菌生长的适宜酸碱度为6575。董雪1实验证明，适宜黑脉羊肚菌菌丝生长的pH为6O70，最适pH为6O。总之，
26、不同种(或株)的羊肚菌对营养、温度、pH、水分、光照、氧气等的要求是不相同的。同一菌株的羊肚菌，在不同的营养条件下，菌丝的形态、颜色等培养特征也不完全相同。这些差异反映了羊肚菌生理特性的多样性。这种多样性，造成驯化条件的多变性前 言而增加了驯化难度253营养生理类型羊肚菌是腐生菌还是菌根菌还存在很多争议。Repin(1901)以及丁文奇等均认为羊肚菌是一种腐生菌。有人报道在周围无任何植物的大田旁发现大量羊肚菌，而推测它是腐生菌。沙业雄(1990)在广东的调查也同意这一观点n”。王法渠哺1(1993)通过八类生长基质证实，羊肚菌是“腐生型”真菌，无植物菌根和其他真菌“共生”关系。杨绍斌等啪1(2
27、001)通过对生长基质的研究，亦说明羊肚菌是腐生型真菌。但同时还认为羊肚菌的产生可能与阔叶林(如活的细杨树根)之间存在共生关系，树根从土壤中吸收营养物质和微量元素，供给其本身和羊肚菌，同时羊肚菌的代谢作用产生的代谢产物对树根的生长有作用。R01e等证明羊肚菌对榆属等植物有菌根关系。有人认为羊肚菌与菊科蜂斗叶有菌根关系。德国科学家FBuscot m1(1992)在研究高羊肚菌(舭砌ej妇订8招)的生活习性、生理生态时，发现羊肚菌菌丝环绕欧洲云杉丹c韶丑6je占的根形成菌核，与子实体相连的羊肚菌菌核周围围绕着许多菌根，推测羊肚菌可能需与欧洲云杉形成外生菌根，并从中获得生长因子利于自身的生长发育和菌
28、核的形成，经实验室研究，发现已与紫晶腊蘑厶cca“a御t加t铂形成菌根的欧洲云杉可促进羊肚菌菌核的形成。Buscot采用组织分离方法自新鲜羊肚菌子实体分离其菌丝体时，常分离到一种细菌(我们也发现了同样的现象)，当将此细菌与欧洲云杉、羊肚菌菌丝体共培养时，羊肚菌与欧洲云杉形成了前菌根(”鲫ycorrhiza)。美国科学家JLD“lstr等哪!(2000)等在实验室条件下观察到羊肚菌彪P占c以册招和高羊肚菌彪以a括与松科的西方落叶松妇rfrcjdB日妇s、小特捻Pinus contorta、蓑国黄松Pinus ponderosa帮貔该松Pseudotsuga menziesii形成典型的外生菌根，
29、与浆果鹃爿姗肥jPsjj形成的外生菌根缺乏蘸套和哈蒂氏网。显然，羊肚菌属的各个成员的营养方式是腐生、共生或两者兼之已成为一个新的课题，植物、细菌在羊肚菌生活史中究竟扮演着怎样的角色也是一个值得深入研究的问题，其结果可能对羊肚菌菌核形态建成和子实体分化研究起着关键的作用。254细胞学研究Volk从细胞学角度揭示了羊肚菌的生活史，并特别指出，羊肚菌营养菌丝的每个细胞分区中，平均有lO15个细胞核，且常发生菌丝融合，作为静止结构的菌核，实际上首都师范大学硕士学位论文 羊肚菌菌丝体培养及筒丝分化研究是由初生菌丝或次生菌丝的重复分枝及菌丝末端的膨胀构成的假菌核。子囊的发育是通过自核交配而不是通过子实体子
30、实层基内菌丝融合而重新形成异核体“”。陈易飞、林彬分别对羊肚菌核粗柄羊肚菌的子实体进行显微观察“。”1。李绮等应用电子显微镜对羊肚菌子实体的亚显微结构：膜边体、高尔基体、线粒体、隔膜和伏鲁宁体进行了观测研究“”。崔宗强等”(2003)认为羊肚菌原生质体制备的最佳条件为：以培养3d的菌丝体为材料，O6molL蔗糖溶液为稳渗剂，15浓度的溶壁酶30条件下酶解3个小时，可得原生质体产量最高为335106个100mg。以06m01L的蔗糖溶液做稳渗剂，cYM再生培养基上得到原生质体再生率为O171。张鉴铭等“(1989)则用2纤维素酶+1崩溃酶+O5半纤维素酶+05蜗牛酶30处理液体培养的尖顶羊肚菌菌
31、丝体45小时，原生质体产量达62106个lOOIIlgml。此法分离到的原生质体再生能力很强，液体培养18小时即可再生成菌丝。刘士旺等咖1(1997)的研究结果表明，多种酶混合使用较单一酶效果好，选用4mgm1蜗牛酶+5lIlgm1溶壁酶+4mgm1的混合酶解系统，原生质体产量最高，原生质体再生率较前人提高55倍。影响原生质体形成的因素有机械作用、菌丝培养方式、菌龄、酶解时间、温度、稳定剂及缓冲液。255生物化学与分子生物学研究由于羊肚菌多形态的特性给分类学家带来了一定的困难，所以许多学者在实验室中应用一些分子生物学和生化技术对羊肚菌种的划分做了大量的工作，因此，生化和分子生物学研究成果是在分
32、子水平上对羊肚菌属分类的重要依据。1987年，Gessner等应用同功酶电泳技术的实验证明，羊肚菌彪esc以鲫抬和美味羊肚菌彪如JJcj伽是同一种，只是在形态上分为两个类群。1989年，v01k和Leonard371根据菌丝融合反应试验提出了同一种观点。林彬等“”(1995)用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，检测尖顶羊肚菌彪月、粗腿羊肚菌澎cams如e5、羊肚菌彪e占cu，鲫妇三种的酯酶及漆酶同工酶的酶带数、着色、迁移率方面的差异，认为其与子实体的外观形态相吻合。因此该检测结果可同形态、生化、遗传等方面结合起来，对羊肚菌的分类进行综合鉴定。龙正海等“”(1995)发现，不同生长时期羊肚菌菌丝体的氨基酸含
33、量变化较大。与此同时，酯酶同工酶活性也呈现相应的变化规律，表明羊肚菌菌丝生长过程中酯酶同工酶活性与氨基酸代谢之间存在一定的相关性。同功酶分析还发现，不同子实体菌株及同一子前 言实体不同单孢菌株间的酯酶同工酶酶谱基本相同，子实体与菌丝体均具有稳定的9条酶带。王新宇等1(1996)等对黑脉羊肚菌Mangusticeps、尖顶羊肚菌Mnica和羊肚菌Mesculenta在相同培养液及相同培养条件下，菌丝体产量、总蛋白及可溶性蛋白的含量无显著差异；同一个种在含不同浓度麦芽糖、蛋白胨和VB。培养基上生长时，总蛋白和可溶性蛋白质含量无显著差异，但菌丝体产量差异较大，酯酶同工酶的组成也有一定的差异。酯酶同工
34、酶的存在，对于研究羊肚菌的代谢与分类同样具有一定的意义。核糖体核糖核酸(rRNA)是存在于生物细胞内的“活化石”，其基因rDNA分子进化信息量大，趋同性小，可比性强，已被广泛选作生物发育系统学的分子指标，也是系统发育物种概念界定物种的依据之一。Bunyard“(1994)利用28srRNA基因的RFLP研究了羊肚菌生物发育的系统关系，证明种内比种间存在更多的遗传多样性，并且提出黑色羊肚菌和黄色羊肚菌是两个单独的分类组群。胡克兴呻1(2005)通过ITs序列分析，采用最大似然法和邻接法，构建分子系统树，并结合各方面的证据，明确地将试验用地羊肚菌各种划分为黑羊肚菌和黄羊肚菌两个类群；黑羊肚菌类群种
35、彪c鲫jca与彪a，搿，?jc印e占，麒e扫地膨c妇妇差异较大，并支持后三种为同一多态种的观点；黄羊肚菌类群中的彪e脚印妇与彪c，a黜助船区别明显；支持环境影响系统进化的观点。wipt D1(1996)利用双向基因步行技术(Gene w8lking Technique)测定了尖顶羊肚菌和羊肚菌编码rRNA的内部转录区ITS(Internal Transcribed spacer)，结果表明，两个种的ITS有差异，羊肚菌为750bp，尖顶羊肚菌为1150bp。wipt D“31(1999)通过PcRRFLP技术分析了羊肚菌的11个菌株的rDNA的ITs，地区间不存在种内ITs长度的变异，但经序列
36、比较，黄色羊肚菌之间存在差别，而黑色羊肚菌之间却没有差别。通过ITsl和ITS2序列分析，表明这两个组之间有一定的距离。所有这些报道都认为羊肚菌属应分为几个大的分类组群，而现存的种只能说明其表现型的不同。3羊肚菌的栽培技术研究羊肚菌为野生真菌，其产量受季节、气候等因素的制约。所以，一百多年来，羊肚菌的人工栽培研究，一直是真菌学家和业余爱好者最感兴趣的课题之一。早在1883年，英、美、法、德等国家就开始了羊肚菌栽培的研究，直到1982年，美国R。n Ower等首次得到9首都师范大学硕士学位论文 羊肚菌菌丝体培养及菌丝分化研究了室内栽培形成的子实体。我国从上世纪七十年代开始对羊肚菌的栽培进行研究，
37、先后引进和采集了各种羊肚菌品种进行分离、培养、驯化、栽培对比试验，在培养材料、培养方式及栽培管理方面取得了初步的进展，有报道称已经人工栽培成功“1。但虽有人工栽培成功的报道，但试验的重复性仍较差，尚未见大面积的栽培和商业性生产，大面积栽培还有待于进一步研究。权威专家认为，羊肚菌的全程人工栽培尚未真正成功，需要进行应用基础研究，而且工作确有难度，具有挑战性和竞争性。31室外栽培Repin(1892)以经培养多月的羊肚菌做菌种，在种花地上栽培，四年后获得菌体；在经碳酸钙处理至碱性的干叶组成的苗床上和以苹果残物填满的山沟中也都长出羊肚菌。Baron dyvoire(1898)在5、6月把羊肚菌子实体
38、(组织块)接种到菊芋畦中，秋天在菊芋茎基四周施放苹果渣，12周后，再盖上枯枝落叶。翌年春天，除去枯枝落叶，在比较潮湿的条件下，羊肚菌菌丝体在这种基质中蔓延生长。其后年年产生子实体。刘波(19531954)4月中旬在山西羊肚菌产区的自然条件下，进行了新鲜菌丝体人工栽培实验，并获得完全正常的第二代子实体。他的实验结论之一是子实体组织块分离到的菌丝体移到自然条件下可以产生子实体。Paul staments在铺有泥炭或杂木屑补以硫酸钙的火地栽培黑脉羊肚菌挺鲫鲫jc秘获得完全的成功。根据对温度的探索，他认为从自天到夜晚温度波动，一种生理节奏循环，对羊肚菌的形成和发育是至关重要的。室外羊肚菌床常伴有其它蘑
39、菇生长，其中一些被当作“指示者”看待，最普遍的指示者是棕色杯菌(cup fungi)，它们的存在说明这地方确实适于羊肚菌生长。同样的途径可使苹果树基部长羊肚菌。羊肚菌同某些树，象三角叶杨、榆树、橡树、枞树和苹果树的存在直接有关，尤其是三角叶杨似乎像是伴随羊肚菌室外栽培的立项的候选者“”。卢亚兵“(1993)认为影响子实体分化的关键因素，一是菌丝体长满培养料后，需一段时间的低温刺激：二是培养料中需添加自然发生过羊肚菌的腐殖土。陈惠群等(1995)采用层播，从1991年冬季开始播种，野外栽培尖顶羊肚菌彪c鲫jca，连续三年均获成功。试验面积由10m2达到40m2，单位产量最高达212朵m2。董淑凤
40、“”(1995)野外栽培美味羊肚菌膨8sc“朝如仅获8株硕大的子实体。试验证明，用组织分离的方法得到的羊肚菌菌丝体可以转化为子实体。并认为菌核是转化成子实体的重要时期，也是营养阶段处于恶劣条件的标志。菌核在外界适宜的条件下转交为予10前 言实体；当外界条件不适宜时，菌核就会老化，致使羊肚菌的人工栽培不易成功。罗凡1(1995)报道，四川省青川县菇农从1990年起开始探索羊肚菌的人工栽培技术，通过模拟野生羊肚菌的生境，己成功地培养出了子实体，有的单产达40朵寸。在清溪菌种场曾发现一特大型丛生羊肚菌，其由64朵组成，鲜重达1825kg，是采用山上熬过香樟油后的经自然堆制的樟木渣作栽培原料人工栽培而
41、成的。李素玲等叫(2000)于1995年开始对羊肚菌进行人工驯化栽培的研究，主要研究了羊肚茵两个种(彪船c“鲫招和彪硼舢tjc印s)在不同栽培原料上和不同栽培条件下菌丝的生长情况、菌核的培养特征以及子实体的形成特性。结果表明，菌核是羊肚菌子实体产生的重要标志和重要阶段；光照、温度和湿度是子实体形成的关键因子；北芪渣对菌核和子实体的形成有刺激作用；人工栽培适宜在杨树林地和苹果园进行；草木灰和杨树根土可促进羊肚菌予实体的产生。李峻志等呻1(2001)于2000年4月在商洛地区的试验点成功地栽培出了分化完全地子囊果。这次单例地成功既支持了以往研究中杨树环境、桐树环境、火烧灰环境及充分的雨水对羊肚菌子
42、实体的发生的积极作用，又否定了羊肚菌予实体的发生必须经过越冬长达7个月的积温变温的生理过程这一传统理论，认为无须越冬的长时间低温刺激，并能获得分化完全、生长成熟的子实体，这是以往未见报道过的。32室内栽培早在1889年，Baron即在用苹果渣和菊芋堆制成的菌床上，用羊肚菌子实体的碎块作菌种栽培过羊肚菌。其后，Molliard(1904，1905)用苹果渣，Matruchat(1909，1910)用废纸浆和腐木混合物以类似方法栽培羊肚荫，都获得了羊肚菌的子实体“。1982年，Ron嘶er首次报道室内栽培羊肚菌彪esc以鲫据获得成功“”。并与GMills及JMala chowski于1986年和1
43、988年申请并获得羊肚菌艇e占叫鲫招的栽培专利“”。羊肚菌的菌丝是以营养食物源长入非营养培养基的，一经物质上的分开，就在营养贫乏的基质中形成菌核，休眠期以后将菌核浸透水，膨胀，当遇到特殊环境条件就质变为羊肚菌。ower的研究之所以成功，主要是采用的方法独创，其技术要点如下：(1) 培养菌核体：选择合适的培养料配方，装入专用容器，装料量占容器空间的70，在料面隔放一张打孔的厚锡纸，在锡纸上面填装5厘米左右的腐殖土。按常规灭菌后，将羊肚菌的菌核菌种接种于土层，置于1822培养710天，菌丝通过土层延伸到培养料获取营养，土层中生出许多菌丝团块菌首都师范大学硕士学位论文 羊肚菌菌丝体培养及菌丝分化研究
44、核。(2) 诱导有性生殖：诱导菌核菌丝进入有性生殖状态才生成子囊果。方法之一：除去外源营养物质，仅由菌核供应营养，迫使营养菌丝发生有性过程；方法之二：大量注水并不断渗漏，洗除可溶性的营养。(3) 保障原基发育：从现原基到子囊果长到3厘米高这段发育期，生态条件不适(需要羊肚菌的野生条件)，子囊果极易败育。(4) 伴生菌问题：羊肚菌生态环境中有一种霉菌(Trichlderma sp)可以促进出菇，这用作用类似银耳的“伴生菌”(香灰菌)。由此可见，搞清羊肚菌的“伴生菌”及其作用，也是人工栽培成功的关键。国内有关羊肚菌室内栽培的报道很多，四川绵阳食用菌研究所采用基因重组技术培育出新菌种，人工栽培羊肚菌
45、成功，并获国家专利。综上所述，由于羊肚菌人工栽培存在着既要造成原基形成的营养生理先决条件，又要有效的诱导有性过程的发生这样的双重困难，所以目前尚不能商业化大规模生产。羊肚菌商业化栽培是全世界很多科学工作者一百多年来梦寐以求的愿望，一旦实现将给人们带来较好的经济效益和社会效益。4羊肚菌菌丝体的深层发酵野生羊肚菌因受气候、温度、湿度、土壤等环境因素的影响，产量很少，价格十分昂贵，人工栽培目前还不能大规模进行，达不到商品化生产的水平，因而羊肚菌资源匮之。随着生物技术的进步，发酵工业技术的应用，传统的生产模式也得到了更新。菌丝体发酵技术成为解决资源问题的最佳途径，给羊肚菌产业化生产开辟了一条新路。由于
46、羊肚菌的菌丝体不但含有子实体的各种营养物质和活性成分，而且还能较好的保持子实体独特的风味，并适于工业化发酵生产，所以羊肚菌菌丝体深层发酵研究近年来得到了迅速的发展，开发利用菌丝体、发酵液的报道也很多。深层发酵技术具有易操作、菌丝体繁殖快、生产周期短、产量大等优点，以深层发酵菌丝体和发酵液为主要原料提取羊肚菌各种营养成分和活性成分，可明显降低成本，提高生产效率。19j8年JSguest首次在发酵罐内培养羊肚菌菌丝球，并进行了25000加仑的生产试验。上世纪60年代以来，美、法等国开始大规模生产其菌丝体，用以制造调味品，其，。品深受消费者的欢迎。目前国外已经能够进行500L以下规模的发酵生产，并出
47、现了专前 言门适于羊肚菌发酵的设备。我国研究虽然较为滞后，目前仍处于中小试阶段，但近年来研究取得了较大的进展。人们对羊肚菌液体菌种、液体培养基进行了广泛的研究。选择适于深层发酵的羊肚菌菌株，是进行羊肚菌发酵生产的前期工作之一。根据索洛茂斯提出的观点，适合深层发酵生产菌丝体的食用菌株应具备三大条件；发酵菌丝体中含有大量蛋白质等营养物质；能在简单培养基上很好生长；生长速度快。刘士旺等哪(1998)探索了羊肚菌液体培养条件并筛选了培养基。结果表明，PYG(含01酵母提取物的PDA)合适的液体培养条件是：25，100rmin，装量100m1500皿1三角瓶，加10粒玻璃珠，pH75。正交试验筛选的摇瓶
48、培养基组成为麦芽汁50，玉米粉15，酵母提取物O5，蔗糖15。以此培养基为基础，筛选出4种菌丝生物量较高的液体培养基。赵良启等日(1999)通过摇瓶正交试验研究了尖顶羊肚菌液体发酵的合适条件为：培养温度27，装量50ml260m1三角瓶，培养时间4d，而pH、通气量对尖顶羊肚菌液体发酵的影响不显著；最佳培养基配方为：淀粉45，豆饼粉12，酵母膏01。韩建荣(1998)对羊肚菌膨唧以鲫招、尖顶羊肚菌彪c册jca、黑脉羊肚菌彪a，】娜jc印s和粗柄羊肚菌彪锄辩f阳s在玉米粉培养基或马铃蓦粉培养基上进行固体发酵时，菌丝生物量之间无显著差异。在培养基中添加氮源，能显著提高菌丝生物量、n一淀粉酶活力和淀粉降解率。添加ca2+能显著提高固体培养基中的淀粉酶活力，同时能有效地减缓发酵时过程中pH的变化。试验得出降解淀粉的理论最佳条件为：黄豆粉添加量15，发酵时间25天，ca2+浓度01。由此表明，羊肚菌完全可以用于发酵生产新型玉米食品或马铃薯食品，羊肚菌的固体发酵条件及生理生化、营养指标的研究有待于进一步深入。5羊肚菌的开发应用前景51化学成份研究羊肚菌中含有丰富的营养成份，而且野生羊肚菌和栽培的子实体中成份基本一致，子实体和菌丝体中所含成份也大致相同。现在有关成份方面的报道并不多，主要集中在多糖、酶类、氨基酸、毗哆酮抗生素、脂肪酸等几个大的方面。张广伦等“71(199
