1、摘 要I致病菌细胞的近红外光谱法鉴别研究食品与生物工程学院 荣宗有指导教师 刘建学摘要近红外光谱检测技术是近年来发展最快的检测技术之一，具有无损、快速、高效、方便和环保的特点。本文以对数生长期的沙门氏菌、单增李斯特菌等致病菌为研究对象，考察近红外光对致病菌细胞的作用，分析致病菌细胞的近红外光谱的图谱，利用基于主成分分析技术的投影判别分析对致病菌细胞的鉴别和检测限进行了研究，得到了预期结果。1.无菌操作，采用平板划线分离培养法和纯种细菌移种技术对沙门氏菌、单增李斯特菌分离培养进行研究，结果表明，沙门氏菌、单增李斯特菌在营养琼脂培养基、含 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂（TSAYE）均能生长良好。
2、2.采用光电比浊法，对沙门氏菌的对数生长期进行研究。通过比较沙门氏菌的生长曲线图，研究其生长趋势，确定了沙门氏菌的对数生长期，最后选定 16h为沙门氏菌的培养时间。3.根据不同浓度梯度的沙门氏菌、单增李斯特菌的全细胞、细胞壁和细胞质的近红外光谱图谱，利用基于主成分分析技术的投影判别分析，研究两种菌的近红外光谱鉴别方法。结果表明，不论是利用全细胞、细胞壁还是细胞质的近红外光谱分析，都可以将大肠杆菌和单增李斯特菌区分开来。关 键 词：近红外光谱，沙门氏菌，单增李斯特菌，鉴别,检测限Research on the near-infrared spectrum detection limit of P
3、athogenic bacteria cellsCollege of Food and Biological Engineering Rong zong-youLiu Jian-xue ProfessorABSTRACTNear-Infrared spectroscopy detection technique is one of the fast developing technology，which is nondestructive, fast, efficient, converient, and environmentally 摘 要IIfriendly. The thesis ex
4、plores the action mechanisms of near-infrared spectroscopy in the detection of pathogenic bacterias, analyses the near-infrared spectral of pathogenic bacteria cells, taking Salmonella and L.monocytogenes as the research object which is in the logarithmic growth phase, using projection discriminant
5、analysis based on PCA to identification of the pathogen bacteria cells ,as well as the examination limit for a study to get the expected result.1. Aseptic technique, Research the Growth situation of Salmonella and L.monocytogenes in both Nutrient agar culture medium and Including 0.6% yeast paste pa
6、ncreas cream peptone soybean agar-agar culture medium(TSAYE). The results show that，Salmonella and L.monocytogenes are not high to the nutrition demand and Can grow well in both Nutrient agar culture medium and Including 0.6% yeast paste pancreas cream peptone soybean agar-agar culture medium(TSAYE)
7、.2. Carried out a research into logarithmic growth phase of Salmonella and L.monocytogenes, taking the use of photoelectric turbidimetry. In this study, the growth curves of Salmonella and L.monocytogenes is compared to they growth chart, from which we can see the growth trend of Salmonella and L.mo
8、nocytogenes so as to determinate the Salmonella and L.monocytogenes logarithmic growth phase. At last, 16h was selected to the Salmonella culture time and 18h for the L.monocytogenes culture time.3. A study about the near-infrared on the distinction method of both pathogenic bacteria cells had been
9、carried out, using the projection discriminant analysis which is based on principal component analysis. according to the different concentration gradient of near infrared spectra of the Salmonella and L.monocytogenes entire cell、cell wall and cytoplasmic . The results show that，KEY WORDS: Near-Infra
10、red spectroscopy, Salmonella, L.monocytogenes, distinction目 录III目 录第 1 章 绪论 11.1 沙门氏菌的概论 11.1.1 沙门氏菌的病原学特性 .11.1.2 沙门氏菌的发病机理 .11.1.3 沙门氏菌导致的临床症状 .21.2 单增李斯特菌的简介 .21.3 有害致病菌检测技术的概述 .21.3.1 色谱技术 .31.3.2 化学比色法 .31.3.3 近红外光谱检测技术 .41.4 近红外光谱概论 .41.4.1 近红外光谱分析技术的原理 .41.4.2 近红外光谱分析技术的应用 .51.5 立题意义和研究内容 .51
11、.5.1 立题意义 .61.5.2 研究的主要内容 .6第 2 章 沙门氏菌、单增李斯特菌分离培养的研究 72.1 前言 .72.2 材料 .82.2.1 菌种 .82.2.2 试剂 .92.2.3 培养基 102.2.4 试验仪器 102.3 试验方法 .112.3.1 沙门氏菌、单增李斯特菌的活化及分离培养 .122.3.2 沙门氏菌、单增李斯特菌的观察计数 .132.4 结果与分析 .132.4.1 沙门氏菌的生长情况 .142.4.2 单增李斯特菌的生长情况 .152.5 小结 .16目 录IV第 3 章 沙门氏菌对数生长期的研究 .173.1 前言 .173.2 材料 .183.2.
12、1 菌种 .183.2.2 试验仪器 .193.3 试验方法 .193.3.1 沙门氏菌的活化及分离纯化 .203.3.2 沙门氏菌种子液的制备 .203.3.3 比浊法测定沙门氏菌的生长曲线 .213.4 结果与分析 .213.4.1 沙门氏菌的生长曲线 223.5 小结 .22第 4 章 沙门氏菌、单增李斯特菌细胞的近红外光谱研究 .224.1 前言 .224.1.1 菌种 .234.1.2 主要仪器 .234.1.3 主成分分析（PCA）方法介绍 .234.2 试验内容 .244.2.1 样品的制备 .244.2.2 光谱信息的采集 .244.3 结果与分析 .244.3.1 沙门氏菌、
13、单增李斯特菌的鉴别 .254.3.2 小结 .25第 5 章 总结和展望 .265.1 总结 .265.2 展望 .26参考文献 27致 谢 27第 1 章 绪论1第 1 章 绪论1.1 沙门氏菌的概论沙门氏菌属（Sallmonall）是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一个大属，它包括 2000 多个血清型。病原学认为，沙门氏菌是一种人畜共患和食源性疾病的致病菌。世界各地的食物中毒中，英国、中国沙门氏菌食物中毒居首位，美国居第二位 1。食源性致病菌作为一个严重的公共卫生问题是影响食品安全的主要原因之一，它严重危害着人们的生命健康从而造成重大经济损失。因此，对致病性细菌的快速检测一直是相关
14、研究的热点 2。1.1.1 沙门氏菌的病原学特性(1)形态与染色沙门氏菌为革兰氏阴性，较为细长的杆菌，大小为（13m）（0.40.9m），不产生芽孢，一般无荚膜，但在黏液样变异时，可见菌体黏液层增厚。(2)培养特性沙门氏菌为需氧或兼性厌氧。生长温度为 1042，最适温度为 37。适宜 pH 为 6.87.8。对营养要求不高，一般在普通培养基上均能良好生长。在培养集中若加入硫代硫酸钠、胱氨酸、血清、葡萄糖、淀粉、脑心浸液、胶体硫或甘油等，均有助于本菌的生长。普通琼脂培养基：培养 24 小时后，形成中等大小、圆形或近似圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐的菌落。普通肉汤培养基：生长良好，均等浑浊。
15、(3)抗原构造沙门氏菌具有复杂的抗原结构，一般可分为 4 种，即菌体抗原，又称为 O抗原；鞭毛抗原，又称为 H 抗原；表面抗原，又称为 K 抗原；以及菌毛抗原。(4)抵抗力沙门氏菌对热及外界环境的抵抗力属于中等，60作用 2030min 即被杀死 3。1.1.2 沙门氏菌的发病机理河南科技大学学士学位论文2沙门氏菌引起食物中毒时，需感染大量菌才能致病。沙门氏菌随食物进入消化道以后，在小肠和结肠里繁殖，附着于肠黏膜上皮并侵入粘膜下组织，使肠黏膜发炎，从而抑制了肠黏膜对水和电解质的吸收，并引起水肿、出血等。随后在通过肠黏膜上皮细胞之间侵入粘膜固有层，在固有层内引起炎症。未被吞噬细胞杀灭的沙门氏菌，
16、经淋巴系统进入血液，而出现一时性菌血症，引起全身感染。同时活菌在肠道或血液内崩解出毒力较强的大量的菌体内毒素，而引起全身中毒症状。1.1.3 沙门氏菌的临床症状沙门氏菌食物中毒的临床症状是由活菌和内毒素的协同作用引起的，以急性胃肠炎型为最多，潜伏期一般 1224h，有时可短至 68h 或长至 2d，开始时症状为头痛、全身乏力、发冷和恶心等，以后出现呕吐、腹痛和全身酸痛。病人发热大都在 3940，重病人出现寒战、抽搐和昏迷等。病程 37d，一般愈后良好。但老人、儿童和体弱者，如不及时进行急救处理，也可导致死亡，死亡率约为 1%左右 4。1.2 单增李斯特菌的简介单核细胞增生李斯特菌（Lister
17、ia monocytogenes）是一种人畜共患病的病原菌。本菌为兼性厌氧革兰氏阳性小杆菌，营养要求不高，无芽孢，耐碱不耐酸，对环境抵抗力较强。它广泛存在于自然界中，在 4的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一 5。单增李斯特菌属细胞内寄生菌，不产内毒素，可产生一种溶血性的外毒素。T 细胞在清除本菌中起重要作用，细胞免疫功能低下和使用免疫抑制剂者较易感染，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。单增李斯特氏菌在各年龄段人群中均可发病，尤其免疫机能低下者和新生儿、孕妇、老年人等，病死率高达 20%30% 。1.3 有害致病菌检测技术的概述“民以食为天”，随着人们生活水
18、平的提高，食品安全问题日益成为人们关注的焦点。据统计，全球每年腹泻病例 15 亿，造成 300 多万儿童死亡，其中第 1 章 绪论370%是由于各种致病性微生物污染的食品和饮水所致。为此，食品检验日益显的重要，而微生物检验又是食品检验的一个重要内容。如何快速而准确地检测被称为“头号杀手”的食品中致病菌，是确保食品安全的首要任务。但是传统的微生物检验方法，包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，不仅步骤复杂，而且耗时费力，难以适应飞速发展的现代食品生产和流通领域。因此为了确保食品的安全性，开发快速检测食品有害微生物的方法非常重要。目前，人们在微生物快速灵敏检测技术上投入了大量的精力，主
19、要有色谱技术、化学比色法、阻抗技术、免疫分析技术、生物传感器技术、PCR 技术、基因芯片技术、蛋白质芯片技术和生物学发光检测法。此外，一种新型的检测方法即近红外光谱检测技术也应运而生。1.3.1 色谱技术原理是将微生物细胞经过水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化处理后，使之分离尽可能多的化学组分供气相色谱仪进行分析。不同的微生物所得到的色谱图中，通常大多数的峰是共性的，只有少数的峰具有特征性，可被用来进行微生物鉴定，分析检测各种常见细菌、酵母菌、霉菌等。汤丹剑用全细胞水介皂化及甲醋法的方法，通过气相色谱仪检测了几株食品微生物细胞长链脂肪酸构成。结果表明在食品微生物领域中，利用细胞脂肪
20、酸差异性进行菌种的快速鉴别是可行的，其鉴定结果与传统鉴别的结果相符。Newark 微生物鉴定系统3就是用气相色谱法检测一种饱和脂肪酸(微生物代谢物)的含量，达到鉴定微生物的目的。1.3.2 化学比色法常用的化学比色法包括各种检测试剂和试纸，两者都是利用迅速产生明显颜色的化学反应检测待测物质，可通过与标准比色卡比较进行目视定性或半定量分析，随着检测仪器的不断发展，与其相配套的微型检测仪器也相应出现。在微生物检测方面，美国 3M 公司的 petrifilm TM Plate 系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数 6。1.3.3 近红外光谱检测技术FTIR 技术以未损伤
21、细胞的 FTIR 光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整河南科技大学学士学位论文4个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征，因此可以区分生化信息上的差别 7。红外光谱法（FTIRS ）早在 20 世纪 50 年代起就开始运用于区分不同的微生物 8。1991 年，Naumann 等在 Nature 杂志中验证了 FTIR 具有判别、分类和鉴别微生物的能力，这篇论文及其后续的相关文章成为红外光谱法在微生物研究领域的经典参考文献 9。Curk 等用中红外进行了酵母菌的分类鉴别研究；Helm 等对某些细菌的细胞组成用红外光谱方法进行了鉴别等 10。研究表明，这些微生物大分子不仅在中红外
22、谱区有吸收，在近红外谱区也有吸收。Janie Dubois 等人利用细菌细胞在不同波长范围(1000 -2350nm)的近红外吸收,通过近红外光谱技术对细菌进行了分类鉴定,从而揭开了近红外光谱技术在微观世界应用的序幕 11。此外，还有 PCR 技术、生物技术、基因芯片技术、蛋白质芯片技术、生物学发光检测法等。1.4 近红外光谱概论近红外谱技术（NIR）是 20 世纪 80 年代发展起来的一种高效快速的现代分析技术，在分析化学领域里被誉为分析“巨人”，它综合运用了计算机技术、光谱技术和化学计量学等多个学科的最新研究成果，以其独特的优势在多个领域得到了日益广泛的应用。并已逐渐得到大众的普遍接受和官
23、方的认可。近红外区域按美国材料检测学会（ASTM）定义是指波长在 7802526nm、波数为 128203959cm-1 范围内的电磁波 12。习惯上人们将近红外区划分为近红外短波（7801100nm ）和近红外长波（ 11002526nm）两个区域。近红外光谱主要是含氢基团 C-H、O-H、N-H、S-H、P-H 等振动的倍频和合频吸收的综合表现 13。不同的物质含有不同的基团，而不同基团或同一集团在不同化学环境中的近红外吸收波长与强度都有明显差别，所以近红外光谱具有丰富的结构和组成信息，可以作为获取信息的一种有效载体，非常适合用于碳氢有机物质的组成性质测量。有机物分子对近红外光谱的各个波长
24、的不同吸收率在光谱上表现出波峰和波谷，因此，近红外光谱主要用于有机物定性鉴定和定量分析 14。1.4.1 近红外光谱分析技术的原理1.化学计量学尽管近红外光谱理论上非常适合用于碳氢有机物质的组成性质测量，但是第 1 章 绪论5在该区域内，含氢基团化学键振动的倍频与合频吸收强度很弱，灵敏度相对较低，吸收带较宽且重叠严重，因此，传统的定量分析比较复杂且困难。化学计量学的发展为这一复杂问题的解决奠定了数学基础。化学计量学（Chemometrics）综合使用数学、统计学和计算机学等方法，是一门从化学测量数据中提取信息的新兴的交叉学科。大量化学计量学方法被写成软件，并成为近红外光谱仪的重要组成部分 15
25、。2.工作原理近红外光谱分析技术是利用被测物质在其近红外光谱区内的光学特性快色估测一项或多项化学成分含量 16,17。被测样品的光谱特征是多种组分的反射光谱的综合表现，各组分含量的测定基于各组分最佳波长的选择，按照下式回归方程自动测定结果：组分含量=C 0+C1(Dp)1+C2(Dp)2+Ck(Dp)k (1)式中：C 0k 为多元线性回归系数；(Dp) 1k 为各组分最佳波长的反射光密度值(D= lgp ， p 为反射比 )。该方程准确的反映了定标范围内一系列样品的测定结果，与实验室常规测定法之间的标准偏差 SE 为：SE=(y-x)2/(n-1)1/2 (2)式中：x 表示实验室馋鬼法测定
26、值，y 表示近红外光谱法测值，n 为样品数。1.4.2 近红外光谱分析技术的应用近红外光谱分析技术诸多优点决定了它应用领域的广阔。在食品行业方面，近红外光谱技术可用于食品的品质分析，如研究农产品的新鲜度、检测水果坚实度和品质、检测水果糖度和酸度、控制烤制品的质量、检测酒类发酵过程中酒精及糖分含量变化、预测不同肉类特性、测定乳制品中营养成分、辨别食用油的真伪等等 18-21。在林业方面，其应用更有着常规方法无法比拟的优越性，如无损检测木材密度和性质、木材品质育种和种质资源鉴定、林业种子质量的检测、森林掉落物分解检测 22,23。在农业方面，可应用于作物的品质分析和评价、用于作物品种资源鉴定和品质
27、育种、用于作物抗性指标分析 24,25。在药学研究领域，可对药物原料的晶粒大小、晶型、洁净度、表观密度和旋光性等进行全面的分析，可对药物制剂进行分析，也可进行药物的在线监测控制 26。在烟草行业，主要是应用于对烟草化学成分的检测、烟气分析、烟叶类型或产地判别、卷烟配方识别、卷烟真伪鉴别、卷烟材料分析、烟叶物理指标测定等方面。在其它领域如石油化河南科技大学学士学位论文6工、高分子化工和基本有机化工、纺织工业等也都有近红外光谱技术的广泛应用。近红外光谱技术在微生物领域的应用也有了新的发展，目前大部分的研究对象为细菌和酵母菌，少数为真菌和藻类。1.5 立题意义和研究内容1.5.1 立题意义进入 90
28、 年代，近红外分析技术逐步受到分析化学家的重视，应用逐步扩展到石油化工、医药、生物化学、烟草、纺织品等领域,现已发展成为一种独立的分析技术活跃在光谱分析领域。傅立叶变换近红外光谱(FTNIR)分辨率高，不仅能提供分子基团特征的振动吸收谱带，而且能敏锐地探测分子基团及周围环境的变化。细胞的近红外光谱能够反映核酸、蛋白质、糖蛋白和生物膜等分子在细胞内的含量、构型、构象及其所发生的变化。通过建立其近红外光吸收模型，找到食品中稳定期的沙门氏菌、单增李斯特氏菌的近红外特征吸收光谱，使得不同致病菌能够区分开来。因此，通过不同浓度梯度的沙 门 氏 菌 、单增李斯特菌细胞的 FTNIR 谱来获得沙 门 氏 菌
29、 、单增李斯特菌的近红外光谱信息，继而研究单增李斯特氏菌、沙 门氏 菌 的近红外光谱的鉴别方法 ，以及检测限，将有可能对有害微生物的鉴别测定提供一种快速简便的检测方法，具有较好的应用前景。此外，近红外光谱分析技术在微生物学方面的应用，又可能为人类疾病的早期诊断提供科学依据。1.5.2 研究的主要内容1. 研究食源性致病菌沙门氏菌、单增李斯特菌的分离培养方法；2. 研究食源性致病菌沙门氏菌、单增李斯特菌的生长曲线；3. 研究食源性致病菌沙门氏菌、单增李斯特菌的鉴别方法，以及检测限；第 1 章 绪论7第 2 章 沙门氏菌、单增李斯特菌分离培养的研究2.1 前言细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖
30、的技术。细菌在自然界中分布极广，数量大，种类多，它可以造福人类，也可以成为致病的原因。大多数细菌可用人工方法培养，即将其接种于培养基上，使其生长繁殖。培养出来的细菌用于研究、鉴定和应用。细菌培养是一个复杂的技术。因此，对沙门氏菌、单增李斯特菌的分离培养进行研究具有重要的意义。2.2 材料2.2.1 菌种沙门氏菌、单增李斯特菌试管斜面 （河南科技大学微生物实验室）2.2.2 试剂牛肉膏 北京双旋微生物培养基制品厂蛋白胨 北京双旋微生物培养基制品厂琼脂 国药集团化学试剂有限公司氯化钠 天津市津沽工商实业公司氢氧化钠 天津市科密欧化学试剂有限公司 胰胨 国药集团化学试剂有限公司多价胨 国药集团化学试
31、剂有限公司酵母膏 天津市津沽工商实业公司葡萄糖 北京双旋微生物培养基制品厂磷酸氢二钾 天津市科密欧化学试剂有限公司2.2.3 培养基（1）营养肉汤培养基 牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g，加入 1000mL 水溶解，并调pH7.27.4，121高压灭菌 15min。河南科技大学学士学位论文8（2） 养琼脂培养基牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 18g，加入 1000mL 水溶解，并调pH7.27.4，121高压灭菌 15min。（3）含 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉汤培养基（TSBYE）胰胨 17g、多价胨 3g、酵母膏 6g、氯化钠 5g、磷酸氢二钾 2.5g、葡萄
32、糖2.5g、蒸馏水 1000mL，121高压灭菌 15min。（4）含 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂培养基（TSAYE）胰胨 17g、多价胨 3g、酵母膏 6g、氯化钠 5g、磷酸氢二钾 2.5g、葡萄糖2.5g、琼脂 15g、蒸馏水 1000mL，121高压灭菌 15min。2.2.4 试验仪器表2-1 主要仪器及生产商Table2-1 The main instruments type and manufactures仪器名称 生产商高压蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂超净工作台 苏州净化试验设备有限公司电子天平 常熟市意欧仪器仪表有限公司电热恒温培养箱 海跃进医疗器械一厂恒温振荡培养箱
33、上海福玛试验设备有限公司低温冰箱 青岛海尔股份有限公司2.3 实验步骤2.3.1 沙门氏菌、单增李斯特菌的活化及分离培养（1）沙门氏菌、单增李斯特菌的活化从冰箱中取出沙门氏菌、单增李斯特菌试管斜面，在超净工作台，用接种环各自取一环接入营养琼脂平板、含 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂培养基（TSAYE）平板中，倒置于 37恒温培养箱中培养 24h。（2）沙门氏菌、单增李斯特菌的分离取出活化后的平板，在超净工作台，分别挑取发育良好的孤立菌落，再各第 1 章 绪论9自划线接种于营养琼脂平板、（TSAYE）平板中培养 24h。（3）沙门氏菌、单增李斯特菌的培养预先将 50mL 营养肉汤培养基装于 25
34、0mL 三角瓶，50mL 含 0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉汤培养基（TSBYE）装于 250mL 三角瓶，放入超净工作台，打开紫外灯灭菌 30min。取出沙门氏菌试管斜面、单增李斯特菌试管斜面，在超净工作台分别用接种环取一环沙门氏菌于营养肉汤培养基，取一环单增李斯特菌于（TSBYE）培养基。放于恒温振荡培养箱 37下培养。24h 后取出，在超净工作台中分别用移液枪各吸取 0.1mL 于三个营养琼脂平板、三个（TSAYE）平板，涂布法涂均匀，分别贴上标签（沙门氏菌0、0、0，特单增李斯特菌 1、1、1）。所有平板放于恒温培养箱中 37下倒置培养 24h。2.3.2 沙门氏菌、单增李斯特菌的观察计
35、数培养 24h 后，从恒温培养箱中取出平板，观察沙门氏菌、单增李斯特菌的生长情况，以及进行菌落计数。必要的时候用放大镜观察和计数。2.4 结果与分析2.4.1 沙门氏菌的生长情况表2-2 沙门氏菌的生长情况Table2-2 The growth situation of Salmonella沙门氏菌编号 0 0 0 平均值平板计数计数 153 146 142 147营养琼脂生长情况 形成中等大小，圆形或近似圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐的菌落。可以看出，表 2-2 所示的数据基本符合沙门氏菌的典型培养特性。营养沙门氏菌在营养琼脂培养基上生长良好。2.4.2 单增李斯特菌的生长情况表2-3
36、 单增李斯特菌的生长情况河南科技大学学士学位论文10Table2-3 The growth situation of Listeria monocytogenes单增李斯特菌编号 1 1 1 平均值平板计数计数 242 236 247 241TSAYE生长情况 形成的菌落很小，圆形、表面光滑、无色透明、边缘整齐，水滴样。可以看出，表 2-2 所示的数据基本符合单增李斯特菌的典型培养特性。单增李斯特菌在（TSAYE）培养基的生长情况良好。2.5 小结沙门氏菌在营养琼脂培养基的生长情况基本符合沙门氏菌的典型培养特性；单增李斯特菌在（TSAYE）培养基的生长情况也基本符合单增李斯特菌的典型培养特性。
37、它们都能够良好的生长。结果表明，沙门氏菌、单增李斯特菌对营养的要求均不高，在普通培养基上均能良好生长。河南科技大学学士学位论文11第 3 章 沙门氏菌对数生长期的研究3.1 前言沙门氏菌繁殖速度很快，根据其生长速率常数 R，可把其生长周期分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。延滞期又叫调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间细胞数目不增加的时期。对数期又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。此时菌体细胞生长的速率常数 R最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的增代时间短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，群体的形态与生理特征最一致，
38、抗不良环境的能力强。稳定期又叫最高生长期，此时生长速度逐渐趋向于零。衰亡期，稳定期后死亡率逐渐增加，出现了“负生长”。处于对数生长期的细胞随时间变化成倍增长，菌体生长代谢旺盛，繁殖力、抗不良环境和噬菌体的能力强，活力最佳，最适合进行试验研究。故本试验采用处于对数生长期的沙门氏菌进行研究，通过测定沙门氏菌生长曲线的方法进行。3.2 材料3.2.1 菌种沙门氏菌试管斜面 （河南科技大学微生物实验室） 3.2.2 试验仪器表3-1 主要仪器及生产商Table3-1 The main instruments type and manufactures仪器名称 生产商电子天平 常熟市意欧仪器仪表有限公司
39、高压蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂超净工作台 苏州净化试验设备有限公司可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械一厂恒温磁力加热搅拌机 郑州金育科贸有限公司恒温振荡培养箱 上海福玛试验设备有限公司第 4 章 大肠杆菌等致病菌细胞的近红外光谱研究123.3 试验方法3.3.1 沙门氏菌的活化及分离纯化1菌种的活化：依照菌种说明，将沙门氏菌接入营养琼脂平板中，倒置于37恒温培养箱中培养 24h。2菌体的分离纯化：取出活化后的平板，挑取单个菌落，划线接种于营养琼脂培养基培养 24h。3.3.2 沙门氏菌种子液的制备挑取纯化培养后的沙门氏菌单个菌落，将其接种于装有 50m
40、L 营养肉汤培养基的三角瓶中，37 210r/min 振荡培养 24h。3.3.3 比浊法测定沙门氏菌的生长曲线取 25 支大试管，用记号笔标明培养时间，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 h。在超净工作台中，用移液枪准确吸取 25mL 培养 24h 后的沙门氏菌种子液，移于装有 500mL 营养肉汤培养基的大三角瓶中，快速摇匀。立即分装于已编号的 25 支大试管中，每支试管装 15mL，将分装后的试管置于摇床上，37 210r/min 振荡培养。分别在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
41、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 h 将编号为对应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定光密度值。以未接种的营养肉汤液体培养基作空白对照，选用600nm 波长进行光电比浊测定。按编号从小到大的顺序依次进行测定。比浊法是在比浊计或比色计上测定培养液中微生物的数量。由于细菌悬液的浓度与光密度值成正比，因此可利用光密度值来推知菌液的浓度，并将测得的OD 值与其对应的培养时间作图，即可绘出沙门氏菌在一定生长条件下的生长情况曲线图。3.4 结果与分析河南科技大学学士学位论文133.4.1 沙门氏菌的生长曲线以未接种的营养肉汤培养基作空白对照，
42、选用 600nm 波长进行比浊测定，按编号从小到大的顺序依次进行测定。沙门氏菌比浊测定结果表 2-2。表 3-2 沙门氏菌菌液 OD 值Table3-2 The value of optical density of Salmonella培养时间（h） 光密度值（OD ）空白对照 0.0411 0.0412 0.0423 0.0424 0.0435 0.0446 0.0497 0.0548 0.0589 0.06210 0.06611 0.06912 0.07113 0.07414 0.07515 0.07716 0.07917 0.08318 0.08419 0.08320 0.08421
43、0.08422 0.08423 0.08324 0.082由表 3-2 沙门氏菌菌液 OD 值，以沙门氏菌培养时间为横坐标、以菌液光密度值为纵坐标，绘制沙门氏菌生长曲线图 3-1。第 4 章 大肠杆菌等致病菌细胞的近红外光谱研究14图 3-1 沙门氏菌生长曲线图Fig.3-1 The growth curve of Escherichia coli00.010.020.030.040.050.060.070.080.091 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25培 养 时 间 /h吸光度（OD）系 列 1由图 3-1 可知，沙门氏菌在 0-5h 时特征表现为生长迟缓，5
44、-16h 时生长迅速、呈对数生长趋势，16h 以后逐渐进入稳定期和衰亡期。此沙门氏菌生长曲线与典型生长曲线有所不同，对数期很长,长达 11 个小时，但基本符合典型生长曲线延缓期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期的划分。5-16h 为沙门氏菌的对数生长期。3.5 小结比浊法测定的是活菌数和死菌数之和，所绘制的生长曲线可能会有一定的误差，但这并不影响生长曲线所反映的沙门氏菌的生长情况。从图 3-1 沙门氏菌生长曲线可以看出，光电比浊法所测生长曲线基本符合典型的沙门氏菌生长曲线图。图 3-1 分析可知 5-16h 为沙门氏菌的对数生长期，本实验选择可选 16h 为沙门氏菌的培养时间，从而进行下步的试验
45、。河南科技大学学士学位论文15第 4 章 沙门氏菌、李斯特菌细胞的近红外光谱研究4.1 前言传统的细菌分类、鉴别方法主要是显微镜法、生理生化相结合的方法，这些方法的准确度不是十分理想，而且操作复杂、费时费力，重要的是难以实现自动化及计算机化。近红外光谱法可提供细胞分子基团特征的振动吸收谱带，而且能探测细胞分子基团及其周围环境的变化。通过测定沙门氏菌、单增李斯特菌细胞质、细胞壁的近红外谱图，采用分析软件 OPUS 6.5 中主成分识别方法对光谱数据进行分析。4.1.1 菌种沙门氏菌试管斜面、李斯特菌试管斜面 （河南科技大学微生物实验室）4.1.2 主要仪器超声破碎仪VECTOR-33 型傅立叶变
46、换红外光谱仪 （德国 Bruker 公司）4.1.3 主成分分析（PCA）方法介绍主成分分析（principal component analysis，PCA ）是多元统计中的一种数据压缩技术，该方法广泛用于化学实验数据的统计分析，是化学计量学中的基础方法 27。PCA 是对多变量数据进行统计处理的一种数据线性投影方法，它在尽可能保留原有信息的基础上将高维空间中的样本映射到较低微的主成分空间中。通过分析原始数据的相互关系，采用坐标变换的方法对数据进行正交变换，消除数据间的相关关系，具有分析多变量主次关系的功能。近红外光谱谱带严重重叠，可造成分析的困难，而 PCA 在不丢失主要光谱信息的前提下选
47、择为数较少的新变量来代替原来较多的变量 ，可有效解决光谱重叠的问题，从而提取所需的化学信息。4.2 试验内容第 4 章 大肠杆菌等致病菌细胞的近红外光谱研究164.2.1 样品的制备按照方法 3.3.1 进行沙门氏菌细胞的活化和分离纯化，由试验小结 3.5 中所得结论选择 16h 进行沙门氏菌种子液的制备，之后 8000r/min 离心分离湿菌体，以一定体积无菌水分三次洗涤沉淀部分，充分震荡摇匀使菌体分散开来，平板菌落计数法进行菌落计数结果为 80 亿/mL。另用移液枪移取 1mL 菌液于大试管中，加入 9mL 无菌水，充分振荡摇匀形成 10 倍稀释菌悬液，然后逐级进行 19 次 10倍稀释，
48、制成一组 20 个浓度梯度的沙门氏菌全细胞悬液，浓度梯度值呈比差为10 的等差序列，备用。用超声波破碎仪破碎沙门氏菌的全细胞，破碎参数选为 400W、破碎 5s、间隔 5s、实际破碎总时间 50min 进行沙门氏菌细胞破碎，之后 15000r/min 离心分离，沉淀部分为细胞质、上清液为细胞质。将细胞质悬液充分震荡摇匀，用移液枪移取 1mL 菌液于大试管中，加入 9mL 无菌水，充分振匀形成 10 倍稀释菌悬液，然后逐级进行 19 次 10 倍稀释过程，制成一组浓度梯度的沙门氏菌细胞质悬液，20个浓度梯度值呈比差为 10 的等差序列，备用。一组 20 个浓度梯度的沙门氏菌细胞壁悬液的制备同细胞
49、质悬液制备过程。单增李斯特氏菌样品的制备：对单增李斯特氏菌进行细胞的活化和分离纯化，选 18h 进行单增李斯特氏菌种子液的制备，之后 8000r/min 离心分离湿菌体，以一定体积无菌水分三次洗涤沉淀部分，充分震荡摇匀使菌体分散开来，平板菌落计数法进行菌落计数结果为 175 亿/mL。选择超声波破碎参数为 500W、破碎4s、间隔 5s、实际破碎总时间 50min 进行单增李斯特氏菌细胞破碎，之后15000r/min 离心分离，沉淀部分为细胞壁、上清液为细胞质。三组 10 倍稀释浓度梯度的单增李斯特氏菌细胞壁、细胞质悬液的制备同沙门氏菌。4.2.2 光谱信息的采集1. 试验参数选择（1）分辨率 仪器的分辨率影响近红外光谱的分析，而且对不同组分的影响是不同的，对于光谱重叠严重的部分，提高分辨率有利于光谱的分析，但过高
