1、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.1 基金项目： 农业行业科研专项：饲草饲料资源开发利用技术研究与示范 (201203042)； 国家自然基金资助项目 (No. 31060041; 51366009)；甘肃省自然基金（ 1212RJYA008， 1212RJYA034）；兰州理工大学 “红柳青年教师培养计划 ”(Q201207)。 作者简介：王永刚，讲师，研究方向：微生物基因工程 通讯作者：马建忠，研究员，研究方向：植物基因工程 考马斯亮蓝 G-250 与牛血清白蛋白相互作用 研究 王永刚 1， 王世伟 1，
2、李云春 1，冷非凡 1， 马建忠 1， 王晓力 2, 庄岩 1 （ 1.兰州理工大学 生命科学与工程学院， 甘肃 兰州， 730050） （ 2.中国 农业科学院 兰州 畜牧与兽药研究所 ， 甘肃 兰州， 730050） 摘要 ： 利用紫外 -可见光谱 、傅里叶变红外光谱 、 圆二色谱 和分子建模技术 研究 了 考马斯亮蓝 G-250 与牛血清白蛋白（ BSA）的相互作用。 紫外 -可见光谱测定 结果表明， 随 BSA 的浓度 的 增加， 以 1:1 形成复合物，在不同温度条件下，结合形成 常数值分别为5.03104、 3.04104、 2.84104和 1.99104 Lmol-1， 随温度
3、 升高而减小 ， 整个反应过程是焓、熵联合驱动 自发进行 ， 热力学焓变（ H）和熵变（ S）分别为 45.3229 kJmol-1和 139.1847 JK-1mol-1，说明 分子间作用力以氢键和范德华力 为主；采用傅里叶红外技术研究了作用前后 BSA 中 -螺旋 特征酰胺带（ I 和 II）的变化，结果表明 酰胺带 I 由 1650 cm-1移动到 1710 cm-1，酰胺带 II 从 1544 cm-1移动到 1573 cm-1， -螺旋结构降低 ； 圆 二色谱测定结果 和分子对接技术 进一步验证了 BSA 结构的变化， -螺旋含量由 42.15% 下降至 1.27%。 关键词： 牛血
4、清白蛋白；考马斯亮蓝 G-250；光谱 法 ；圆二色 谱 ； 分子建模技术 ；相互作用 Study on Interaction of Coomassie Brilliant Blue G-250 with Bovine Serum Albumin WANG Yong-gang1,WANG Shi-wei1,LI Yun-chun,LENG Fei-fan,MA Jian-zhong1,WANG Xiao-li2,Zhuang Yan1 (1. Lanzhou University of Technology, School of Life Science and Engineering, L
5、anzhou 730050,China) (2. Lanzhou institute of husbandry and pharmaceutical science of CAAS, Lanzhou 730046,China) Abstract: The interaction of coomassie brilliant blue G-250 (CBBG-250) with bovine serum albumin (BSA) was investigated by the methods of UV-Vis spectroscopy, Fourier transform infrared
6、spectroscopy (FT-IR), circular dichroism (CD) and Molecular modeling technology. The results show that BSA can interact with CBBG-250 and form the complexes of CBBG-BSA in a molar ratio of 1:1 with the maximum wavelength at 595nm. The apparent binding constant Ka of CBBG-250 with BSA is 5.03104(298K
7、)、 3.04104(303K)、 2.84104(308K) and 1.99104 Lmol-1(313K) at different temperatures, respectively. The formation constant of complex decreased with increasing temperature by the different BSA concentration. The whole process is joint by enthalpically and entropically. The enthalpy change ( H) and ent
8、ropy change ( S) were calculated to be 45.32 kJmol-1 and 139.18 Jmol-1K -1, indicating that the hydrogen bonds and Van der Waals forces played a dominant role in the interaction. The conformational investigation revealed the -helical structure decrease, and the infrared absorption band of Alpha heli
9、x change. The amide band I moved from 1650 cm-1 to 1710 cm-1, and amide band II moved from 1573 cm-1 to 1544 cm-1 by FT-IR spectra and Molecular modeling technology, and the content of -helical structure decrease from 42.15% to 1.27% by circular dichroism. Keywords:Bovine Serum Albumin;Coomassie bri
10、lliant blue G-250;Spectrum;Circular dichroism;Molecular modeling technology; Interaction 1976 年 Bradford 首次 报道 CBBG-250 与牛血清白蛋白（ Bovine Serum Albumin， 简称 BSA）可以 发生络合反应 形成蛋白质 考马斯亮蓝蓝色 复合物 溶液，引起 考马斯亮蓝 G250 乙醇磷酸溶液 特征吸收波长 465nm 红移， 于595nm 处产生新的 最大吸收峰 ， 即 复合物 的 特征吸收峰 ，更为重要的是， Bradford 发现该复合物特征吸收峰大小与 BSA 浓
11、度 在一定范围内 呈线性 梯度 关系， 因此 被作为蛋白质 定性鉴别和 定量分析的主要 方法 之一 1。 由于该法网络出版时间：2015-11-24 11:17:30网络出版地址：http:/ Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.1 具有灵敏度高、特异性强、操作简单及干扰因素少等优点，被广泛应用于 生化分析 中。目前 关于 CBBG-250 与生物大分子蛋白质的研究主要集中在变色 反应 机理 3,4,5,6和 定量 方法改进 7-13两方面 ，其中研究较多的有高通量和痕量蛋白检测方法的优化、不同样品来源蛋白质检测方法条件的优化
12、，而 CBBG-250 与蛋白质分子 相互作用机理研究甚少， 有研究认为蛋白质与 CBBG 溶液反应的灵敏度和准确度取决于蛋白质中 芳香族氨基酸残基 和 碱性氨基酸的含量，尤其是 精氨酸。 在前期的研究中作者发现 CBBG-250 响应 牛血清白蛋白、牛血红白蛋白、胃蛋白酶 等 不同蛋白质的光吸收值有显著差异 7。由此，作者认为 CBBG-250 与蛋 白质的反应存在组成和结构差异性，也可能在相互作用力的方式上存在差异。 光谱法 和色谱法 是研究小分子化合物和 蛋白质 相互作用的主要 技术 手段 14-20，包括紫外 -可见光谱、荧光光谱、红外光谱和圆二色谱等。本研究采用了 紫外 -可见 光谱
13、法测定了 CBBG-250 与 BSA 之间的结合常数、热力学参数等， 辅以 傅里叶变红外光谱 和圆二色谱法 研究了两者 反应前后 BSA 官能团 结构 的变化，进一步 揭示了CBBG-250 与 BSA 两者见可能存在的相互作用 。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 仪器：紫外 -可见分光光度计（ Cary 50， 美国 Varian 公司）；荧光光度计 (RF-5301PC，日本岛津公司 )；红外 -拉曼分光光度计（ FTIR-850，美国 Nicole 公司）；圆二色谱仪 (Jasco-20c，日本岛津公司 )；移液枪（ BR704180，德国 Brand 公司） ； 电子天平（ AB
14、104-N，梅特勒）。 试剂：无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司， 2012年 06月 05日，分析纯 AR）， 85%磷酸（天津市百世化工有限公司， XK13-011-00007， 2002年 02月 16日，分析纯）；牛血清白蛋白（ Roche， No.B0040），考马斯亮蓝 G-250（ Solarbio， Ultra Pure Grade， No.C8420）等。 1.2 方法 1.2.1 溶液配制 1.0 mg/mL BSA 溶液的配制：准确称取 100 mg BSA，超纯水溶解并定容至 100 mL； 5.0 mg/100mL CBBG-250溶液的配制：准确称取 5.0mg
15、CBBG-250溶于 5 mL 95%乙醇充分溶解，再向其中加入10 mL 85%磷酸，超纯水定容至 100mL。 1.2.2 紫外 -可见分光光度法分析 在 298K、 303K、 308K、 313K 条件下，对已知浓度的 BSA 和不同浓度 CBBG-250 溶液的结合作用进行 200800 nm 的紫外可见吸收光谱，探究最大吸收峰，并在最大吸收峰测定光吸收值，绘制相应的热力学曲线。 1.2.3 傅里叶变换红外光谱分析 分别取少许 0.5 mg/mL BSA、 10.0 mg/100mL CBBG-250 溶液及两者的反应液 涂膜，于室温下间隔 4 cm-1测定4000-400 cm1波
16、数范围内 的官能团结构 。 1.2.4 圆二色谱分析 准确移取 5 mL CBBG-250 溶液于 10 mL 比色管中，加入 BSA 标准溶液 1.0 mL，以超纯水定容，反应 10min。使用 1 mm 石英池，于室温下测定 200 280 nm 范围内 BSA 与 CBBG-250 发生相互作用前后的 CD 谱，分析 BSA 中 -螺旋结构含量的变化，计算公式为： ( 208 4000)/(33000 4000)100%17。 1.2.5 分子对接建模技术分析 用 Discovery Studio 软件建立考马斯亮蓝 G-250 的结构模型，采用分子对接软件 Autodock vina
17、1.1.2 分析 BSA蛋白质的活性区域，并分析两者间的结合位点和作用力类型。从分子水平阐述考马斯亮蓝 G250（图 1）和牛血清白蛋白 BSA（ PDB ID： 4F5S）的作用机制。除了特别说明，软件分析中所有的参数都使用默认值。 2 结果与讨论 2.1 CBBG-250 与 BSA 相互作用的紫外 -可见光谱 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.1 2.1.1 CBBG-250 对 BSA 的紫外 -可见光谱 分别在 298K、 303K、 308K、 313K 条件下，对已知浓度的 CBBG-250 溶液
18、和不同浓度 BSA 溶液的结合作用进行 200 800 nm 的紫外 -可见吸收光谱 。结果如图 1，从图中可以看出在不添加 BSA 溶液的条件下，温度对CBBG-250 溶液稳定性的影响非常下， CBBG-250 溶液在 465nm 和 646nm 处有特征吸收峰，而随着逐渐添加 BSA溶液， CBBG-250 溶液吸收峰发生变化， 结果如图 2 所示，从图中对比可以看出 CBBG-250 与 BSA 结合物特征吸收峰为 595nm，随着 BSA 浓度的增加，光吸收值逐渐增加，呈 梯度增加 ，因此被作为蛋白质定量的主要分析手段之一，此外对比各图可以发现在同等条件下，温度在 313K 时， B
19、SA 与 CBBG-250 反应的 光吸收值增加幅度减缓，直至不变，由此推测，温度对两者之间的结合存在一定的影响。 图 1 不同温度下 CBBG-250 溶液 的紫外 -可见 光谱图 （ CBBG-250 浓度为 0.05 mg/mL； 15 温度 为 298K、 303K、 308K、 313K） Fig. 1 UV-Vis spectra of CBBG-250 solution at different temperature 图 2 不同温度下 BSA 和 CBBG-250 相互作用的紫外 -可见光谱图 （ CBBG-250 浓度为 0.05 mg/mL； 15 BSA 的浓度依次为
20、0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 mg/mL） Fig. 2 UV-Vis spectra of CBBG-250 with different concentration of BSA c(CBBG-250) 0.05 mg/mL, the concentration of BSA (15): 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 mg/mL 2.1.2 表观结合常数 Ka 和 CBBG-250 与 BSA 的作用力类型 在作者的前期研究中 7， 利用荧光光谱法研究获得 CGGB-250与 BSA 是以 1:1的分子结合模式相互作用的结论， 为了进一步
21、验证两者间的作用力类型，进一步采用紫外可见分光光度法 进行了确证。 在反应体系中 CGGB-250与 BSA 的反应式为： CBBG-250+ BSA = BSA-CBBG-250，则： K = BSA-CBBG-250/CBBG-250BSA （ 1） 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.1 由式（ 1）得， BSA0= BSA + BSA-CBBG-250 = BSA + K BSA CBBG-250 （ 2） CBBG-2500= CBBG-250 + BSA-CBBG-250 = CBBG-250 + K
22、BSACBBG-250 （ 3） 式中， BSA0和 CBBG-2500分别为 BSA 和 CBBG-250 的起始浓度。 假设 BSA0CBBG-2500，可得 BSABSA0，由式（ 3）得， CBBG-250 = CBBG-2500/（ 1+ K BSA0） （ 4） 由于 BSA0CBBG-2500，加之反应后溶液吸光度 A 与 BSA-CBBG-250成正比，符合朗伯利尔定律，即：A = BSA-CBBG-250 L （ 5） 式中， 为摩尔吸光系数， L 为吸光池厚度。当 L=1 时，将式（ 1）代入式（ 5）得 A = KBSA CBBG-250 （ 6） 将式（ 4）代入式 (
23、6) A = KCBBG-2500/（ 1+ KBSA0） BSA0 （ 7） 因为 BSABSA0，式（ 7）可整理为： CBBG-2500 /A = (1/ K )(1/BSA0)+ 1/ （ 8） 式（ 8）可简化为 1/A = (1/K CBBG-2500)(1/BSA0) +1/ CBBG-2500 （ 9） 根据 1/A 和 1/BSA0作图，由图中的斜率及截距，即可求得表观结合常数 Ka 和 值，同时因为 G = RT ln K = H T S，得到 ln K = H/RT + S/R，以 ln K 对 1/T 作图，通过斜率和截距可以计算出 H 和 S。 本工作分别研究了 29
24、8K、 303K、 308K、 313K 下的 BSA 与 CBBG-250 相互作用的紫外 可见光谱，测定波长为 A595nm。利用不同温度下的实验结果，以 1/A 对 1/BSA0作图，得到不同温度下的关系曲线及相关系数 r，结果见图 3。 从图中可以看出不同温度下的曲线均呈良好线性关系， 相关系数分别为 0.99578、 0.99649、 0.99029和 0.9983，表明结果有 一定的可靠性 。 随着 BSA 浓度的增大结合物的吸光度也增大；而随着温度的升高，结合物的吸光度则明显降低，斜率降低，由斜率和截距分别计算得到不同温度下的结合形成常数 K，见表 1。由表 1 可知 K 值随着
25、温度的增加而减小，说明温度的变化对 CBBG-250 与 BSA 作用的影响较大；以 ln K 对 1/T 作图，结果见图 4，通过计算得知 G0 且随着温度的增加而逐渐增大，由此得出在不同温度，不同浓度 BSA 下， BSA 和CBBG-250 的反应是自发过程，并且该过程逐渐趋近于稳定， H0 说明该反应是放热过程。根据反应前后热力学焓变 H 和 熵变 S 的相对大小判断生物大分子与小分子结合力性质的热力学规律 15,16,17， S0， H0 体现氢键和范德华力作用力，得出 BSA 和 CBBG-250 的反应过程中有氢键和范德华力作用力参与。 表 1 CBBG-250 与 BSA 反应
26、的热力学参数 Tab.1 Thermodynamic parameters of BSACBBG-250 reaction process T/K K/(mol/L)-1 r G/( kJ mol-1) H/(kJ mol-1) S/(JK-1mol-1) 298K 5.03104 0.99578 -4.0021 -45.3229 -139.1847 303K 3.04104 0.99649 -2.7984 308K 2.84104 0.99029 -2.6726 313K 1.99104 0.9983 -1.7963 1/A3 4 5 6 7 8 9 10 110 .81 .01 .21 .
27、41 .61 .82 .02 .22 .42 .62 .81/ BSA0/ 10-4( L . m ol-1)298K303K308K313KY=0 .0 9 8 4 3 X+0 .4 9 4 8 5 R 2 =0 .9 9 5 7 8Y=0 .1 3 7 6 6 X+0 .4 1 8 1 9 R2= 0. 99649Y=0 .1 5 4 1 3 X+0 .4 3 7 6 1 R2=0 .9 9 0 2 9Y=0 .1 8 3 2 4 X+0 .3 5 6 1 7 R2=0 .9 9 8 33 .20 3 .22 3 .24 3 .26 3 .28 3 .30 3 .32 3 .34 3 .3
28、60 .60 .81 .01 .21 .41 .61/T （ 10 -3 ）lnKY= 5.54136X - 16.74133 R2= 0.96573现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.1 图 3 不同温度下 1/BSA0与 1/A 的关系曲线 图 4 不同温度 1/T 与 lnK 的关系曲线 Fig. 3 Curves of 1/BSA0 and 1/A at different temperatures Fig. 4 Curves of 1/T and lnK at different temperature
29、s 1200 1300 1400 1500 1600 1700C B B G-2 5 0B S AB S A - C B B GW av en u m b er （ cm -1 ）Transmiation(%)1400145015441650142714831573 163512181298132113681512160816611710图 5 CBBG-250 与 BSA 作用的 FT-IR 谱图 Fig.5 FT-IR spectra of the interaction BSA and CBBG-250 2.2 傅里叶红外光谱法 为了 进一步 研究 CBBG-250 与 BSA 在 反应
30、过程中 BSA 二级结构的变化，对反应前后各体系成分进行了傅里叶红外光谱研究，结果如图 5，从图中可以看出，加入 CBBG-250 后， BSA 的峰形没有明显变化，但是蛋白质在红外区的特征吸收带，酰胺 I 带（ 1600-1700 cm-1）和酰胺 II 带（ 1600-1500 cm-1）的峰位发生了蓝移，酰胺带 II从 1544 cm-1 移动到 1573 cm-1，酰胺带 I 由 1650 cm-1 分裂成 1710 cm-1，即 BSA 中的 -螺旋（特征带 1650-1658 cm-1）和 -折叠（ 特征带 1620-1640 cm-1， 1675 cm-1）结构发生了变化 19，
31、 -螺旋结构降低 ， 即在反应过程中 CBBG-250引起 BSA 肽链上氨基、羧基氢键的重新排列 。氢键作为维系蛋白质双螺旋结构的主要作用力，一旦发生变化，蛋白质的构象也会随之而变。 CBBG-250 分子的磺酸基、氨基、苯环羟基不但可以与蛋白质侧链上的氨基、羟基以及羧基发生反应，或形成氢键，也可以与蛋白质肽键结构形成氢键， 从而 改变 C=O、 C-N 键的伸缩振动，引起NH 平面弯曲，造成酰胺带峰位的改变， 氢键改变， 使蛋白质二级结构发生变化。 2.3 圆二色谱法 远紫外区是蛋白质肽键的吸收峰范围，主要反映蛋白质主链构象， BSA 典型结构特征是 -螺旋在 212， 223 nm两处有
32、负 cotton 效应， -折叠在 215nm 左右有负槽，无规卷曲则在 220nm 处出现正峰 17。从图 6 中可以看出，实验中 BSA 中 -螺旋在 209nm 和 222nm 左右出现负 cotton 效应， BSA 与 CBBG-250 结合后， CD 谱的形状没有明显改变，峰位也没有明显移动，计算得到 BSA 的 -螺旋含量从 42.15%降至 1.27%，大部分变为 -折叠。由此说明 CBBG-250 与 BSA 结合 后， BSA 的 二级结构发生了变化，原因可能是 CBBG-250 通过疏水作用力及氢键与组成 -螺旋的氨基酸残基相互作用，破坏了 -螺旋的结构，从而导致 BSA
33、 中 -螺旋含量下降。 200 210 220 230 240-80-70-60-50-40-30-20-100B S AEllipticity/mdegWa v eleng t h /nmB S A - C B B G图 6 CBBG-250 与 BSA 相互作用的圆二色谱图 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.1 Fig. 6 CD spectra of CBBG-250BSA system c(CBBG-250) 0.05 mg/mL, T 303 K, c(BSA) =0.1 mg/mL 2.4 分子对接
34、分析 采用分子对接软件 Autodock vina 1.1.2进一步研究 CBBG-250和牛血清白蛋白 BSA（ PDB ID： 4F5S）的作用机制，得出 BSA 活性口袋坐标为： center_x=4.616， center_y =23.3， center_z=78.812， size_x=47， size_y=47， size_z=47。分别将 CBBG-250对接至 BSA 的活性口袋中，共生成 9种构象，如表 2。我们挑选亲和力 affinity 最高的构象 1进行研究，显示结果见图 7。由图 7a 可以看出， CBBG-250分子中的二苯基胺结构可以与 BSA 中氨基酸 残基 G
35、LN203、LYS204、 ARG196、 GLU464、 ASP108、 LYS465、 LYS106和 TRP147发生强烈的范德华力作用。 CBBG-250分子中一侧的苯基磺酸基伸向碱性氨基酸 HIS105，发生静电相互作用，同时与氨基酸残基 SER104形成双重氢键作用，如图 7b。另一侧的苯基磺酸基结构与碱性氨基酸 LYS242和 HIS246形成静电相互作用。更重要的是，其磺酸基结构可以与氨基酸残基 HIS246和 ASP248形成四重氢键作用，如图 7c。可能正是由于这样一种稳定的作用模式，使得化合物 CBBG-250可以与 BSA 形成稳定的复合物。 表 2 CBBG-250
36、和 BSA 的分子对接结果 Tab. 2 Molecular docking of CBBG-250 to BSA 构象 Affinity (kcal/mol) 1 -8.1 2 -8.0 3 4 5 -7.6 -7.5 -7.3 6 7 8 9 -7.1 -7.0 -6.9 -6.8 图 7 CBBG-250 和 BSA 的分子对接结果 Fig. 7 Molecular docking of CBBG-250 to BSA 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2016, Vol.32, No.1 3 结论 利用紫外 -可 见光谱法研究了 CBB
37、G-250与 BSA 的相互作用机制。结果表明， 在 温度 为 298K、 303K、 308K和 313K 下结合形成常数值分别为 5.03104、 3.04104、 2.84104和 1.99104 Lmol-1， 随温度升高而减小，整个反应过程是焓、熵联合驱动自发进行，热力学焓变（ H）和熵变（ S）分别为 45.3229 kJmol-1和 139.1847 JK-1mol-1，说明分子间作用力以氢键和范德华力为主。 此外，傅里叶红外光谱法和圆二色谱法对 BSA 的构象研究结果表明， BSA 特征谱带 酰 胺 I 带（ 1600-1700 cm-1）和酰胺 II 带（ 1600-1500
38、 cm-1）的峰位发生了蓝移，酰胺带 II 从 1544 cm-1移动到 1573 cm-1，酰胺带 I 由 1650 cm-1分裂成 1710 cm-1，即 BSA 中的 -螺旋（特征带 1650-1658 cm-1）和 -折叠（特征带 1620-1640 cm-1， 1675 cm-1）结构发生了变化， -螺旋结构降低。 圆二色谱的定量计算结果表明， CBBG-250与 BSA 的相互作用引起了 -螺旋含量的降低。从分子对接分析的结果来看，范德华力和氢键作用共同组成主 要结合作用力，进一步证实了 光谱法的研究结果。因此， CBBG-250与 BSA 发生相互作用会对 BSA 的二级结构产生
39、一定影响，两者的相互作用主要以氢键和范德华力为主。 参考文献 1 Bradford M M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantization of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye BindingJ. Analytical Biochemistry, 72, 248-254. 2 Macart M, Gerbaut L. An improvement of the Coomassie Blue dye binding method al
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